2025-08-04
近日，西南林業大學在微生物學領域的《Journal of Fungi》發表新研究成果！本研究通過基因組學、代謝組學和轉錄組學分析，系統揭示了不同栽培條件下暗褐網柄牛肝菌（Phlebopus portentosus）次級代謝產物的合成機制。研究團隊成功組裝了31.4 Mb的基因組， 鑒定出多個次級代謝產物相關的關鍵功能基因。通過共表達網絡分析進一步揭示了PpHOX4、PpHSF1等轉錄因子對代謝途徑的調控作用。該研究為開發利用這一珍稀食藥用菌的活性成分提供了重要的分子基礎。
本研究中真菌denovo測序和分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
研究背景
暗褐網柄牛肝菌（P. portentosus）是一種具有重要食藥用價值的外生菌根真菌，富含蛋白質、多糖等多種活性成分。作為云南等地特有的"黑牛肝菌"，其野生資源因過度采挖而銳減，現已成為首個實現人工栽培的牛肝菌種。研究表明，該菌能產生降血糖、抗腫瘤等多種活性代謝產物，但關于該菌聚酮化合物和萜類物質生物合成途徑的研究仍屬空白，特別是栽培條件對其次級代謝產物影響的多組學整合分析尚未見報道。
研究材料與方法
1、實驗材料
P. portentosus YAF023菌株
2、測序平臺
illumina Novaseq+Nanopore
3、分析內容
真菌基因組近完成圖測序、轉錄組測序、代謝組分析、次級代謝產物基因簇分析、qPCR驗證
研究結果
基因組特征
基因組測序獲得31.42 Mb序列（GC含量48.91%），包含15個scaffolds（N50=2.64 Mb），預測得到7,928個蛋白編碼基因。功能注釋顯示與近緣種Phlebopus sp. FC_14同源度達84.09%，鑒定出206個細胞色素P450、201個碳水化合物活性酶（包括89個糖苷水解酶和53個糖基轉移酶）等關鍵功能基因。特別值得注意的是，該菌含有15個漆酶基因和1個過氧化物酶基因，表明具有木質素降解潛力，但僅鑒定到7個纖維素酶基因，提示其纖維素降解能力較弱。
圖1 基因組特征
毒力因子分析發現837個相關基因，主要涉及效應分泌系統（236）、營養代謝因子（190）和免疫調節（154），而PHI分析顯示"毒力減弱"基因占比最高（1,431個），表明該菌致病性較低。共鑒定出206個CYP450基因，分屬30個超家族，其中CYP620超家族基因數量最多（64個），其次為CYP51（50個）、CYP81（12個）和CYP83（12個）。
圖2 PHI和P450注釋
代謝組學和轉錄組學特征分析
通過LC-MS技術分析了暗褐網柄牛肝菌在不同培養條件下的代謝特征，共鑒定到1582種代謝物，主要包括有機酸、脂質、生物堿等類別。PCA分析顯示各組代謝譜差異顯著，其中L016與L016_BWS組存在651個差異代謝物。KEGG分析表明這些差異代謝物顯著富集于ABC轉運蛋白、氨基酸生物合成等20條代謝通路。轉錄組分析顯示，L016_PDA、L016和L016_BWS組的有效數據占比分別為98.87%、98.96%和98.82%，比對率分別為96.96%、95.35%和96.24%。差異基因分析發現，L016_PDA vs L016組存在431個DEGs（上調232個），L016 vs L016_BWS組存在410個DEGs（上調64個）。這些差異基因主要富集于黃曲霉毒素合成、氨基酸代謝、核糖體等通路，并在解旋酶活性、核糖體組成等生物學過程中富集。
圖3 轉錄組測序結果
次級代謝產物基因簇分析
通過antiSMASH數據庫分析，在P. portentosus基因組中鑒定出24個次級代謝產物合成基因簇，包括18個萜烯合成酶（TPS）、1個非核糖體肽合成酶（NRPS）和5個聚酮合酶（PKS）基因簇。其中，非還原型PKS基因PpPKS1參與苔色酸乙酯合成，在添加丙戊酸的培養條件下表達量顯著提升；部分還原型PKS基因PpPKS2可能參與6-甲基水楊酸合成；雜合型PKS-NRPS基因PpPKS5則與細胞松弛素Z5的生物合成相關。
圖4 次級代謝產物基因簇分析
在P. portentosus中鑒定出18個萜烯合成酶（TPS）基因，包括6個TRI5、8個STCs以及PPS、Ptase、SQS和SQCY各1個。系統發育分析顯示，PpTRI5與球孢白僵菌等菌株的TRI5蛋白聚類，負責合成四環倍半萜β-型毛二烯；PpSTCs可能參與β-柯巴烯等衍生物的合成。轉錄組分析表明，不同培養條件下TPS基因表達差異顯著：PpTRI5和PpSTCs1/5/7在添加丙戊酸的液體培養（L016_BWS）中高表達，而PpSTCs3/6/8在固體培養（L016_PDA）中表達更活躍。此外，通過轉錄因子結合位點預測發現，PpHSF1和PpHOX4可能調控PpPKS1基因表達，Ppzf-C2H2 32和PpHSF5則分別調控PpSTCs8和PpSTCs3的表達。
qPCR驗證
選取了PpPKS1/2/5、PpSTCs6/8等9個次級代謝相關基因及其調控因子進行qPCR驗證。結果顯示qPCR與RNA-seq數據高度一致，證實了轉錄組結果的可靠性。研究發現，PpPKS1/PpPKS2及其轉錄因子PpHOX4/PpTFIIB3在添加丙戊酸的液體培養中顯著上調，而PpSTCs6/PpSTCs8及其調控因子PpHSF5/PpZn-clus9則在固體培養中表達優勢明顯。這一發現不僅證實了培養條件對次級代謝基因表達的特異性調控作用，也為通過優化培養條件定向調控代謝物合成提供了重要依據。
圖5 qPCR驗證結果
結論
本研究通過整合基因組學、代謝組學和轉錄組學技術，系統解析了P. portentosus在不同栽培條件下次級代謝產物的生物合成調控機制。基因組分析發現其含有206個CYP450、201個CAZymes、18個TPSs和5個PKSs等關鍵功能基因。功能解析表明：PpPKS1參與苔色酸乙酯合成，PpPKS2/5分別調控6-甲基水楊酸和細胞松弛素Z5產生，PpTRI5負責倍半萜合成，PpSTCs介導β-柯巴烯衍生物生成。調控網絡分析揭示PpHOX4與PpHSF1協同調控PpPKS1，而Ppzf-C2H2_32和PpHSF5分別調控PpSTCs_8/3的表達。該研究為食藥用真菌活性成分開發提供了重要理論依據。
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文章索引：Kang, Z.; Yuan, X.; Zhang, C.; Wang, Y.; Li, L.; Zheng, Y. Genomic and Multi-Omics Analysis of Phlebopus portentosus: Effects of Cultivation on Secondary Metabolites. J. Fungi 2025, 11, 323. //doi.org/10.3390/jof11040323
