2025-06-30
文章題目: Interfamily co-transfer of sensor and helper NLRs extends immune receptor functionality between angiosperms
技術手段：轉基因、熒光素酶報告基因檢測、離子滲透檢測、煙草瞬時表達、轉錄組測序、WB、qPCR等
中國農業大學植物保護學院郭海龍教授團隊在國際頂級期刊《Cell》首次系統證明通過共轉移感受型與輔助型NLR，可打破NLR免疫受體的“受限的分類學功能”（Restricted Taxonomic Functionality, RTF）瓶頸，在分類學跨度較大的植物間重建ETI免疫信號通路。該研究不僅對深入理解植物免疫系統提供了新的理論基礎，而且對作物抗病分子設計育種提供了新的思路和手段，為更好的利用遠緣物種中抗病基因資源，鋪平了道路。
本研究的轉錄組測序以及部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章亮點
1.綜合技術手段：整合了轉基因、共轉化技術、病原菌接種實驗、熒光素酶報告基因檢測、免疫印跡分析、qPCR、mRNA-seq以及田間試驗等多種技術手段，系統地研究了感受型NLR 和輔助型 NLR 在煙草、大豆、擬南芥和水稻等多種植物間共轉移后的功能及其對植物抗病性的影響。
2.跨物種抗病性提升：將來自辣椒的感受型 Bs2 基因與輔助型 NLR 基因引入至水稻中，成功使水稻獲得了對細菌性條紋病菌（Xoc）的抗性，實現了“基因對基因”的抗性，更重要的是，感受型NLR和輔助型NLR疊加（NLR stacking）的轉基因水稻農藝性狀沒有受到影響，這為利用遠緣植物的抗病基因資源來改良作物抗病性提供了新策略。源自遠緣物種的NLRs可以作為尚未開發的遺傳資源，擴大現有作物的抗病基因庫，為作物抗病育種服務。
研究背景
植物胞內核苷酸結合結構域和富含亮氨酸重復序列受體蛋白 (Nucleotide-binding domain, Leucine-rich repeat containing Receptors, NLRs) 通過直接或者間接的方式識別病原微生物分泌的效應蛋白激活效應子引發的免疫 (Effector-Triggered Immunity, ETI)，引發細胞壞 死進而抵御病原菌的侵染。
然而，不同植物其種間的PRRs和NLRs存在顯著差異，而很多NLRs跨科（interfamily）轉入遠緣物種后常出現抗病功能喪失，造成跨物種轉移應用中受限的分類學功能（Restricted Taxonomic Functionality, RTF），RTF很大程度上限制了NLRs在遠緣作物中開展抗病種質創制的應用。
近年來研究發現，植物中有一類稱為輔助型NLRs (helper NLRs) 位于不同感受型NLR（sensor NLRs）的下游，輔助型NLRs對于感受型NLRs激活后的抗病信號的傳遞起到關鍵作用。其深層機制至今未明，成為植物抗病育種的長期難以突破的技術瓶頸。
源于辣椒的抗Xcv的NLR基因Bs2和以及茄科特有的NRC家族，鑒于前期研究表明Bs2的功能需要依賴這類輔助型NRCs，本研究進一步驗證是否僅共轉移Bs2和NRCs是否就足以在水稻中重構ETI信號通路還是需要額外的茄科特異的蛋白。
技術路線
主要研究結果
1、感受型NLR和茄科輔助型NLR在薔薇科和水稻中的協同表達成功激活了細胞死亡
作者在煙草進行瞬時檢測和離子滲透檢測，發現Bs2可以識別AvrBs2Xoc。與Bs2共表達時AvrBs2 Xoc可以誘導過敏反應（HR）（圖1A），離子滲透檢測結果也證實了這一點（圖1B）。
水稻原生質體瞬時表達螢光素酶（LUC）實驗證明說明Bs2對AvrBs2Xoc的識別需要輔助型NLR的幫助（圖1C）。此外在大豆原生質體的LUC實驗證實Bs2和SaNRC2、SaNRC3、SaNRC4a共轉可抑制LUC活性，Rpi-amr1和SaNRC2、SaNRC3共轉可抑制LUC活性，但和SaNRC4a共轉不可抑制LUC活性(圖1D-E)
圖1：瞬時表達表明輔助型NLR協助感受型NLR克服RTF
2、攜帶感受型和輔助型NLR的擬南芥穩定轉基因系顯示效應依賴性細胞死亡
為了測試茄科NLRs在非薔薇科如擬南芥中的功能，作者構建了表達載體1：感受型NLR、載體2：同時表達感受型和輔助NLR的載體，并在煙草NRC2/3/4敲除突變體中進行測試，發現共表達Bs2、NbNRC2、AvrBs2會引起HR, 共遞送Rpi-amr3、NbNRC2、AvrAmr3會引起HR，而單獨遞送Bs2或Rpi-amr3則不會引起HR（圖S2A-B）。
在擬南芥上的載體1和載體2的轉基因株系結果證明轉入 Rpi-amr3和NbNRC2的擬南芥和轉入 Rpi-amr3 和SaNRC2的擬南芥均能識別效應蛋白AvrAmr3，但在單獨的感受型NLR系中沒有被識別出來（圖2）。
圖2：茄科Rpi-amr3/NRC2感受型和輔助型NLR協同作用導致擬南芥細胞死亡
3、水稻中Bs2的表達以NRC2、NRC3或NRC4依賴的方式賦予對Xoc的抗型
作者將辣椒Bs2及煙草NRC2/NRC3/NRC4輔助型免疫受體共同轉移至水稻中，接種Xoc能誘導NRC2和NRC4在轉基因水稻里寡聚化，表明在水稻里重構AvrBs2Xoc激活Bs2的ETI信號通路，暗示僅轉移茄科植物的感受型和輔助型NLR受體就足以在水稻中重構ETI信號通路（圖3）。
圖3：在水稻中的轉基因系里Bs2與NRC2/NRC3/NRC4協同表達賦予對Xoc的抗病性
4、水稻中異源表達的感受型和輔助型NLRs不影響基礎抗性、生長和農藝性狀
共表達感受型和輔助型NLR免疫受體的轉基因水稻重要農藝性狀如株高、有效分蘗數、每穗粒數、千粒重無明顯差異；轉基因水稻的基礎抗性也不受影響（圖4）。并對轉基因和WT水稻株系做了qPCR，mRNA，WB相關marker基因驗證，發現MAPK、ROS較WT無顯著差異，說明感受型和輔助型 NLRs的聚合不引起免疫自激活（圖4S）。
圖4：ZH11與共表達Bs2和NRCs的轉基因系生長表型、農藝性狀和基礎免疫的比較
研究結論
本研究通過共轉移感受型 NLR 和輔助型 NLR，成功實現了在非茄科植物中擴展免疫受體的功能，使這些植物能夠識別并響應原本無法識別的病原菌效應子，從而增強了它們的抗病能力。
在煙草、大豆和擬南芥中，共表達感受型 NLR 和相應的輔助型NLR 可有效識別特定的病原菌效應子，并觸發免疫反應。特別在水稻中，轉基因水稻共表達 Bs2 和 NbNRC3 或 NbNRC4 時，對 Xoc 表現出完全抗性，與 NbNRC2 共表達時表現出部分抗性，而單獨表達 Bs2 或僅表達 NbNRCs 的轉基因水稻則無抗性。此外，轉基因水稻在田間表現出與野生型相似的生長表型和農藝性狀，且基礎抗性未受影響，表明共轉移策略不會對植物的正常生長和適應性產生負面影響。同時，轉基因水稻在病原菌感染后能顯著上調防御相關基因的表達，進一步證明了其抗病機制的有效性。
這一研究為植物抗病育種提供了新的思路和策略，有助于利用已知的 NLR 資源來增強多種作物的抗病能力。
原文鏈接：
//doi.org/10.1016/j.cell.2025.05.028
