2025-05-20
2025年5月7日，上海交通大學生命科學技術學院唐鴻志團隊與中國科學院戴俊彪團隊合作，在《Nature》正刊發表環境微生物技術新文章！
該篇利用合成生物學方法，對需鈉弧菌進行基因工程改造，開發了高效自然轉化方法和基因組迭代編輯技術INTIMATE。該技術構建的需鈉弧菌工程菌株能在高鹽工業廢水和高鹽土壤中同時降解多種有機污染物，為解決石化廢水排污、海洋石油泄漏等全球性環境問題提供了全新的技術方案。
01、研究背景
工業廢水、石油泄漏和塑料污染對海洋生態安全和人類健康構成嚴重威脅，其中單環芳烴（MAHs）、多環芳烴（PAHs）等有機污染物具有毒性強、難降解的特點，盡管已有研究表明這些有機污染物可以被微生物降解，但這些細菌通常不能處理復雜的有機污染物，然而近年來飛速發展的合成生物學技術為降解菌株的構建提供了可能。需鈉弧菌（Vibrio natriegens Vmax）是一種有前景的底盤物種，作為增長最快的已知細菌，具有耐鹽性強、碳源利用廣等優勢，已被廣泛用于合成生物學。本研究開發了一種基因組工程方法（基于Vmax的迭代自然轉化和放大tfoX效應）將5個基因簇（共43 kb）轉移到Vmax中，構建能夠修復涵蓋氯堿廠和煉油廠工業廢水樣品中的廣泛污染物（從單環苯到雙環和多環化合物）的工程菌株VCOD-15，并評估了其修復能力。
復合有機污染降解菌株VCOD-15設計和構建流程示意圖
本研究涉及轉錄組、微生物組、基因組、代謝組等組學，派森諾提供了微生物組+轉錄組測序及部分分析服務，具體研究方案如下：
02、研究結果
1、底盤菌株篩選與耐鹽機制解析
對多種污染物降解底盤細胞進行對比，發現需鈉弧菌（Vibrio natriegens Vmax）在30.0 g/L至50.0 g/L鹽濃度（LB3、LB5 培養基）下可表現出更高的生物量和污染物耐受性（Fig.1b+Fig2a）。對有無復雜污染物壓力下Vmax菌的轉錄組進行分析，發現其外排泵基因（marA、acrAB-tolC）及 ABC 轉運蛋白基因轉錄顯著上調，增強了對有毒物質的排出能力。
Fig.1b：需鈉弧菌與三種模式菌株不同培養基培養的生物量對比
Fig.2a：在含有污染物的LB1/4、LB、LB3和LB5培養基中，候選菌株的生長速率比較
擴展數據Fig1：復雜有機污染物存在和不存在時Vmax的比較轉錄組分析
2、增加自然轉化率得到優化菌株VCOD-2
通過分析不同啟動子功能，確定組成型啟動子 P(25) 和誘導型啟動子 P(T7) 為高效表達元件，為后續外源基因導入奠定基礎（詳細見補充數據Fig.6）。V. natriegens擁有與自然轉化相關的潛在基因，其表達由全局轉錄因子tfoX15增強。這種表達促進了外源轉化DNA的攝取，并隨后整合到基因組中（詳細見補充數據Fig.7）。因此，研究人員將來自霍亂弧菌的自然轉化調控基因tfoX整合到 Vmax 的染色體上，構建菌株VCOD-2。測試表明VCOD-2可高效整合外源DNA片段（即使低至 0.5 ng）到細菌基因組，轉化效率可提升數倍。同時，線性 DNA 片段（> 1kb）的轉化效率可提升 3-5 倍，且無抗性標記殘留，降低了抗性基因隨水平基因轉移發生環境泄露的生物風險，減少了工程菌株改造中對抗性標記的依賴性，且生長速率并未減少（Fig2(b-f)）。
3、插入位點的選擇
通過基因組分析，在Vmax 染色體上鑒定了 12 個中性基因組位點，作為候選基因簇的插入位點。其中，chr2_297 位點表現出最優的基因整合特性，可穩定整合基因簇，且整合過程未對宿主菌的正常生長造成顯著影響，為后續多基因簇的高效串聯整合提供了理想的基因組平臺（Fig2(g-i)）。
Fig 2b-i：tfoX基因整合位點及線性 DNA 片段的轉化效率，基因組插入候選位點及最優基因整合位點測試
4、人工降解基因簇的設計、合成及驗證
人工挖掘并設計了多條化合物降解基因簇，通過基因合成與組裝技術，利用釀酒酵母進行基因簇的組裝，并將9個基因簇分別整合到chr2_297位點，構建了VCOD-3至VCOD-11系列包含單條降解基因簇的工程菌株。模擬污染物環境進行工程菌株的降解功能測試，降解率和代謝組結果表明，VCOD-3、VCOD-4、VCOD-5、VCOD-6和VCOD-7工程菌有降解能力，并且不會對生長速率產生不利影響。 四種工程菌株，包括VCOD-8、VCOD-9、VCOD-10和VCOD-11，沒有表現出減少相應污染物的能力，且5個菌株聯合體也可以對復雜污染物進行修復。因此，選擇了針對聯苯（bphA(1234)BCDHIJK）、苯酚（dmpLMNOP）、萘（nahA(abcd)BCDEF）、二苯并呋喃（dbfA(1234)BC）和甲苯（xylMNABC）的降解基因簇為候選，并確保其在需鈉弧菌中的高效表達（Fig.3）。
Fig.3：VCOD-3至VCOD-11系列單降解基因簇工程菌株及降解功能測試
5、復雜有機污染物生物修復
為了獲得可以包含5個降解基因簇的單一菌株用來同時處理5種有機污染物，研究人員進行了迭代自然轉化法（INTIMATE）技術的開發。以VCOD-3為初始菌株，利用酵母體內組裝技術，實現了多個降解基因簇（覆蓋單環到多環、雜環有機污染物）的構建。進而利用同源替換策略，迭代整合了5個功能基因簇（總長度 43 kb）到細菌基因組中，構建了多功能菌株VCOD-15。對每輪編輯的中間菌株（VCOD-12、VCOD-13和VCOD-14）及VCOD-15的修復功能驗證，結果表明，每輪中間菌株和最后VCOD-15菌株都具有較好的修復功能，尤其VCOD-15工程菌株在 48 h內對5種目標污染物的去除率均超 60%，其中聯苯降解率達100%，甲苯、二苯并呋喃降解率近 90%，顯著優于天然降解菌（Fig.4）。此外，生長速率和sanger測序表明，插入基因簇對菌株生長無影響，且穩定存在基因組中，這些發現表明，構建的菌株具有遺傳穩定性(詳細見補充數據)。
Fig4：VCOD-15對復雜有機污染物的修復及基因表達水平的研究
6、廢水中的污染物治理
對Vmax菌和其他對照菌株在高鹽環境中的適應性進行研究，結果表明，在鹽度高達 102.5 g/L的氯堿工業廢水（BZI）和52.5 g/L的石油煉化廢水（DLI）中，對照菌株無法生長，而Vmax仍保持活性，體現了其獨特的耐鹽優勢。在活性污泥反應器中，12 h內VCOD-15菌株可完全去除高濃度污染物（1.0 mM 聯苯、1.5 mM 苯酚等）；多平行生物反應器測試顯示，48 h內工業廢水中污染物殘留量均低于檢測限的 2%，且通過16s多樣性測序分析發現VCOD-15菌株在復雜微生物群落中具有占比穩定（Fig.5和擴展數據Fig.10）。
Fig.5:VCOD-15在活性污泥生物反應器中對復雜污染工業廢水樣品的生物修復
擴展數據Fig.10:多并行生物反應器中工業廢水樣品的生物修復
7、土壤中的污染物降解能力驗證
為了評估VCOD-15在土壤中的修復潛力，使用混合了聯苯基（0.77 mmol）的土壤進行了生物修復實驗?。結果表明，在含鹽土壤中，8天內聯苯、苯酚、萘、二苯并呋喃的凈降解量分別達 0.16、0.66、0.21、0.03 mmol/kg，同位素標記實驗證實了污染物被有效的進行了降解（詳細結果見補充數據Fig.16+17）。
03、研究結論
本研究成功開發了基于需鈉弧菌的復合污染物工程菌構建平臺，實現了從代謝通路的挖掘、設計和合成到單一、復合污染物降解菌株的構建、測試、以及在實際工業廢水樣本處理應用的全流程，為石化、氯堿等高鹽廢水處理、海上石油泄漏、微塑料污染等全球性挑戰提供了生物解決方案。同時，INTIMATE技術為多基因簇工程底盤的構建提供了通用技術平臺，使得同一菌株中多種代謝功能的整合以及優質菌種的迭代功能拓展成為可能，可擴展至其他污染物降解體系的構建乃至天然產物合成、高值化學品細胞工程構建等合成生物學應用場景。
原文引用：Su, C., Cui, H., Wang, W. et al. Bioremediation of complex organic pollutants by engineered Vibrio natriegens. Nature (2025). //doi.org/10.1038/s41586-025-08947-7.
原文鏈接：//www.nature.com/articles/s41586-025-08947-7
