2025-04-11
文章題目: miR-29b-triggered epigenetic regulation of cardiotoxicity following exposure to deltamethrin in zebrafish
技術手段：miRNA測序、mRNA測序、顯微注射、免疫熒光染色、組織學染色、qPCR等
浙江大學李舒盈在《Journal of Hazardous Materials》上發表了通過mRNA測序和miRNA測序等技術揭示了溴氰菊酯誘導的斑馬魚心臟毒性及其表觀遺傳調控機制，特別是miR-29b的上調和dnmts的抑制在心臟發育異常中的關鍵作用。
本研究的mRNA測序和miRNA測序以及部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章亮點
1.綜合技術手段：結合miRNA測序、mRNA測序、顯微注射、免疫熒光染色等多種技術，全面解析了溴氰菊酯的心臟毒性及其分子機制。
2.功能驗證實驗：通過miR-29b模擬物和抑制劑的注射實驗，驗證了miR-29b在心臟毒性中的關鍵作用，并進一步探討了其與DNA甲基轉移酶（dnmts）的關系。
3.跨代毒性：發現溴氰菊酯的表觀遺傳效應可以傳遞給后代，導致F1代胚胎中miR-29b表達上調和dnmt1表達下調，進一步證實了其跨代毒性。
4.dnmts的調控機制解析：揭示了miR-29b通過抑制dnmts（DNA甲基轉移酶）導致低甲基化，從而影響心臟發育相關基因的表達。
研究背景
溴氰菊酯（deltamethrin）是一種廣泛使用的擬除蟲菊酯類殺蟲劑，常用于農業、水產養殖和醫藥領域。研究表明，溴氰菊酯對水生生物具有毒性，尤其是在發育中的魚類中，可誘導心臟畸形等發育異常。此外，溴氰菊酯還可能通過表觀遺傳機制（如miRNA和DNA甲基化）對生物體產生跨代毒性效應。然而，關于溴氰菊酯對斑馬魚發育的表觀遺傳影響的研究相對較少。因此，本研究旨在探討溴氰菊酯誘導的心臟毒性和其潛在的表觀遺傳調控機制。
技術路線
主要研究結果
1.溴氰菊酯暴露影響斑馬魚繁殖并導致后代心臟異常
本研究設置了不同濃度的處理組，以觀察斑馬魚在溴氰菊酯環境下所受影響。結果表明，親代斑馬魚暴露于溴氰菊酯會導致后代在受精率、心包水腫率、心率和死亡率方面的顯著變化，尤其是雄性斑馬魚的繁殖能力受到更大影響。這表明溴氰菊酯對斑馬魚的繁殖和后代發育具有顯著的毒性效應）（圖1A-F）。
圖1：成年斑馬魚暴露于溴氰菊酯后，其繁殖性能和后代發育的影響
2.溴氰菊酯暴露誘導斑馬魚心包水腫
斑馬魚幼體心包熒光染色、心率以及心包面積測定結果顯示，溴氰菊酯暴露對斑馬魚幼蟲的心臟發育和功能具有顯著的毒性效應，表現為心包水腫和心率下降（圖2B、C），且這種效應呈劑量依賴性。這提示溴氰菊酯可能通過干擾心臟發育相關機制來誘導心臟毒性。
圖2：斑馬魚幼體心包熒光染色、心率以及心包面積
3.miRNA和mRNA測序和生物信息學分析
本研究對CK組和25μg/L溴氰菊酯暴露處理組的miRNA和mRNA測序，進一步探知溴氰菊酯對斑馬魚發育的表觀遺傳影響。
差異分析得到9個差異miRNA（圖A），先前的研究表明，miR-29b除了在心肌纖維形成中的作用外，還可以調節心臟發育，因此選擇miR-29b進一步分析。并且通過不同物種miR-29b序列保守性的比較（圖B）和分析斑馬魚、人類和小鼠中的表達分布（圖C）獲知dre-miR-29b和hsa-miR-29b可能與下游基因具有相似的靶向關系。
通過TargetScanFish進行靶基因預測，并與差異mRNA取交集，獲得98個上調基因和26個下調基因。使用Metascape中的人類數據庫對dre-miR-29b調節的DEGs進行KEGG富集分析，結果表明與miR-29b相關的調節性DEGs主要富集在神經元發育、心肌肥大和疾病信號傳導中（圖4D）。
用KoBas預測了dre-miR-29b的作用機制，這證實了miR-29b靶向的DEGs可以與心臟發育和DNA甲基化相關的標記基因相互作用（圖4E）。
綜上，作者推測溴氰菊酯暴露引起的心臟毒性很可能與miR-29b的上調有關。
圖3：miRNA、mRNA測序分析以及miR-29b調控網絡
4.miR-29b異常表達干擾心臟發育和功能
miR-29b模擬物和抑制劑注射后的斑馬魚心包面積、心率和心包水腫率（圖4C-F），以及心臟相關基因（nppa、nppb、foxo3a）表達的影響表達變化（圖4G-I）。這些結果表明，miR-29b的過表達對斑馬魚心臟發育和功能具有顯著的負面影響，表現為心包水腫、心率下降和心臟相關基因表達的異常。而抑制miR-29b則能夠減輕這些異常。
圖4：注射miR-29b模擬物和抑制劑后幼魚表型變化
5.通過抑制dnmts過表達miR-29b誘導畸形
鑒于miR-29b和心臟基因之間沒有直接結合位點，先前的一項研究證實，miR29b反向調節dnmts，并且由于抑制dnmts導致的低甲基化會導致斑馬魚發育畸形。miR-29b可能靶向dnmt6和dnmt8，同時影響dnmt1。
為了實現對dnmts的抑制，將DNA甲基轉移酶（dnmt）抑制劑5-氮雜胞苷（5-aza）注射到1-4細胞胚胎中。發現注射5-氮雜胞苷導致心包面積顯著增加，心率降低等，5-氮雜胞苷和溴氰菊酯的組合會導致更嚴重心臟畸形變化（圖5I-L）。
圖5：抑制斑馬魚胚胎中dnmts誘導的心臟疾病
6.成年和幼魚的miR-29b 和dmnt1在不同處理下的變化
結果表明，溴氰菊酯的表觀遺傳效應可以傳遞給后代，導致F1代胚胎中miR-29b表達上調和dnmt1表達下調。這表明溴氰菊酯通過影響親代的表觀遺傳機制，對后代的心臟發育和功能產生負面影響。這些發現進一步支持了溴氰菊酯誘導的心臟毒性和其跨代效應的表觀遺傳機制。
圖6：F0和F1代斑馬魚中的表觀遺傳效應
研究結論
實驗發現，溴氰菊酯暴露會影響斑馬魚心包面積、心率和心包水腫率等表型變化。miRNA和mRNA測序分析發現，miR-29b靶向DEGs富集在心臟毒性相關通路，推測miR-29b可能影響心臟毒性。miR-29b的過表達和抑制實驗表現出其對斑馬魚心臟發育和功能具有顯著的負面影響，證實miR-29b在溴氰菊酯誘導的心臟毒性中起關鍵作用。
鑒于miR-29b和心臟基因之間沒有直接結合位點,但miR29b反向調節dnmts（DNA甲基轉移酶），推測dnmts可能是miR-29b干擾心臟發育的關鍵因素。并且通過注射DNA甲基轉移酶（DNMT）抑制劑5-氮雜胞苷（5-aza），斑馬魚心包面積表型發生變化，心臟相關因子相關的基因的mRNA表達也顯示出異常。
綜上結果表明，miR-29b 通過抑制 dnmts 導致心臟相關基因的異常表達，從而引發心臟畸形。本研究有助于了解糖尿病引起的心臟毒性及其潛在的表觀遺傳毒性機制，為評估其風險提供參考。
原文鏈接：//www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0304389424017928
