2025-03-30
近日，沈陽農業大學在生物學領域的《International Journal of Molecular Sciences》發表新研究成果！本研究從EMS誘變群體中獲得了一個卷葉突變體cl1，并將其命名為Brcl1YS，測序驗證確定了Brc11YS的候選區間位于A02染色體上的97.5 kb區域。序列差異和共分離驗證證實，BraA02g017030.3C是Brc11YS位點最有可能的候選基因。本研究結果將為進一步的定位克隆和功能研究提供線索，并為闡明白菜卷葉性狀的分子機制提供良好基礎。
本研究的BSR測序和分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
研究背景
甘藍型油菜（Brassica rapa）作為一種重要的農作物在全球廣泛種植，主要用于其葉菜類蔬菜，其也部分用于飼料和油籽生產。葉片形狀對植物的光合作用和產量具有重要意義，適度的葉片卷曲能夠通過增強光吸收和減少水分流失來提高植物的光合效率和適應能力，從而促進作物產量的提升。葉片形態的形成是一個復雜的生物學過程，受到外部環境、內部基因表達水平以及激素水平的多重調控。已有研究表明，生長素的不均勻分布是導致葉片卷曲的重要因素之一，而赤霉素作為一種關鍵的植物激素，在植物生長發育的多個階段發揮著重要作用，但其在葉片卷曲中的具體作用尚未被充分揭示。
研究材料與方法
1.實驗材料：Rapid Cycling Brassica rapa（RcBr）通過EMS誘變得到卷葉突變體1（Brcl1），Brcl1與黃沙遜（YS）雜交后自交獲得F2分離群體。從F2分離群體中選出10株卷葉表型個體，與輪回親本YS連續回交三次并自交一次，從中選育出攜帶卷葉性狀的個體并命名為Brc11YS。通過Brc11YS與YS的雜交，構建了新的NIL-F2群體（500株）。
2.測序平臺：Illumina
3.分析內容：BSR-Seq測序分析、遺傳圖譜構建、候選基因預測及共分離驗證和qRT-PCR驗證
研究結果
表型鑒定
在15-50天的相似生長時間內分別選取10個個體來檢測兩個親本Brcl1YS和YS質檢的差異，與YS相對，Brcl1YS的葉片向上卷曲、起皺且植株較矮。在45天后，進一步測定了株高、莖粗、葉長和葉寬。所有四個指標，在YS和Brcl1YS之間均顯示出顯著差異。
圖1 表型鑒定
突變體卷葉性狀的遺傳分析
正反交F1代的表型與卷葉親本Brcl1YS沒有差異。F1代和反交F1代個體之間沒有觀察到顯著差異，兩者都表現出卷葉表型，與卷葉親本Brcl1YS相似。隨后的F2群體的分離比例符合預期的孟德爾分離比例3:1（卷葉vs正常葉）。可以得出結論，卷葉性狀是由B. rapa中的一對顯性基因控制的。
表1 Brcl1YS遺傳特征分析
BSR分析
為了確定Brcl1YS的候選區間，分別從N池和C池中獲得了45,494,770和46,962,128條高質量reads，并將其比對到B. rapa參考基因組。BSR-seq數據中共鑒定出197,180個SNP和210,789個InDel，每個變異位點均用于計算ED5值。結果表明，Brcl1YS的候選區域包括兩個區域：一個位于A02染色體的8,426,511bp-9,253,907bp；另一個位于A10染色體的16,103,255bp-17,842,04bp。
圖2 BSR分析
Brcl1YS基因的精細定位
根據BSR-seq的結果，在兩個候選區間內均勻開發了10對InDel引物。連鎖分析顯示，位于A02染色體（8,426,511 - 9,253,907）的第一個區間與Brcl1YS位點相關聯。利用包含717個個體的F2代隱性純合群體，將候選區間進一步縮小。其中，Indel79、Indel83、Indel86、Indel87、SNP15、SNP3和SNP2位于Brcl1YS位點的一側，而SNP14和SNP1位于Brcl1YS位點的另一側。SNP2和SNP14與Brcl1YS位點緊密連鎖，其遺傳距離分別為0.20厘摩和0.42厘摩。最終，Brcl1YS位點被定位到一個97.5 kb的物理候選區間內。
圖3 精細定位結果
候選基因的序列變異和共分離驗證
根據數據庫比對查找同源基因，發現共有12個基因（BraA02g017010.3C - BraA02g017120.3C）位于候選區間內。結果顯示，BraA02g017030.3C的全長為1524 bp，包含一個外顯子和508個氨基酸。與YS相比，Brcl1YS的啟動子序列保持不變，但其CDS序列包含五個非同義SNP突變。由于G突變為A，導致第1364位的天冬氨酸變為絲氨酸，這一突變與EMS突變特征一致。共分離引物發現這一突變存在于十五個隱性F2個體中，BraA02g017030.3C是最有可能的候選基因。
圖4 候選基因序列分析和共分離候選基因驗證
BraA02g017030.3C的表達模式分析
為了分析BraA02g017030.3C的表達水平，分別從YS和Brcl1YS的不同器官以及不同發育時期的葉片進行qPCR實驗。結果顯示，BraA02g017030.3C在每個器官中均有表達，且在第一片真葉中的表達量最高。
圖5 雙親中BraA02g017030.3C的表達譜
結 論
本研究鑒定了一個EMS突變體Brcl1YS，與受體親本黃沙遜（YS）相比，葉片顯著卷曲。通過BSR-seq測序和重組篩選，確定了Brcl1YS 的候選區間位于A02染色體上的97.5 kb區域。在該候選區域內鑒定出12個基因。序列差異和共分離驗證證實，BraA02g017030.3C是Brcl1YS位點最有可能的候選基因。它與擬南芥的RGL1同源，屬于DELLA蛋白，參與赤霉素信號通路。這些結果有助于理解葉片形態發生的機制，并為白菜的改良提供遺傳資源。
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文章索引：Wang, Lihui, et al. "Identification and Candidate Gene Analysis of Brcl1, a Novel Gene Confers a Leaf Curled Phenotype in Brassica rapa L." International Journal of Molecular Sciences 26.2 (2025): 732.
