2025-03-14
概覽介紹
神經元核內包涵體病（NIID）是一種致命的神經退行性疾病，發病機制不明且治療手段有限。南昌大學洪道俊教授團隊在Cell Commun Signal發表文章“uN2CpolyG-mediated p65 nuclear sequestration suppresses the NF-κB-NLRP3 pathway in neuronal intranuclear inclusion disease”，發現 NIID 中 uN2CpolyG 蛋白與 p65 相互作用，抑制 NF-κB-NLRP3 通路，損害自噬功能，加速神經元死亡。
研究方法
單細胞測序(scRNAseq)：采用10x Genomics的單細胞測序平臺對NIID患者和對照組的細胞進行測序，以分析細胞類型和基因表達差異。
細胞培養與轉染：研究者使用帶有不同數量CGG重復序列的載體轉染細胞，以模擬NIID的病理特征。
Western blotting：用于檢測蛋白表達水平，特別是NF-κB通路相關蛋白和自噬相關蛋白。
免疫熒光染色：觀察蛋白的定位和共定位情況，如p62、p65（NF-κB的一個亞基）和自噬相關蛋白LC3B等。
派森諾的優勢
本研究中單細胞 RNA 測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成，其專業技術為研究的順利開展提供了有力支持，保障了數據的準確性和可靠性，以卓越的服務助力客戶在科研征途上不斷突破，勇登學術高峰。
研究結果
結果1：NIID 組織中 NFKBIA 轉錄水平降低
通過對3例無臨床炎癥特征的NIID患者皮膚樣本進行單細胞RNA測序，研究者發現NIID患者的多種細胞類型（包括成纖維細胞、脂肪細胞、肌上皮細胞和汗腺導管上皮細胞）中存在20個共同的差異表達基因（DEGs）。其中，與NF-κB通路相關的NFKBIA基因（編碼IkBa蛋白）表達顯著降低。在施萬細胞中，NIID皮膚組織的NFKBIA mRNA水平顯著低于對照組，表明其轉錄水平下降。由于IkBa蛋白對NF-κB通路的抑制作用至關重要，這種轉錄水平的降低可能會影響NF-κB通路的活性。
結果2：NIID 細胞中 IkBa 蛋白水平降低及相關變化
用含有不同 CGG 重復次數的 NOTCH2NLC 質粒（CGG9 為野生型，CGG69/100 為突變型）轉染 HEK-293T 細胞后發現，CGG100 細胞中 NFKBIA mRNA 和 IkBa 蛋白水平顯著低于 CGG9 細胞。同時，CGG100 細胞中磷酸化 IkBa 水平升高，p-IkBa/IkBa 比例增加。而且，CGG100 誘導了 p62 陽性包涵體的形成，IkBa 與 CGG100 細胞中 GFP 陽性包涵體存在共定位現象，而 CGG9 細胞中則無此現象，這意味著 NF-κB 通路的抑制狀態可能發生改變。
結果3：NIID 細胞中 p-p65 水平降低抑制 NF-κB 通路
在轉染了CGG100細胞中，p-p65/p65 比例在轉染 24h 后達到峰值，隨后逐漸下降，48h 時顯著低于轉染CGG9的細胞。盡管總 p65 蛋白水平在 CGG100 細胞中 48h 時無明顯變化，但核質分離實驗顯示，細胞質 p65 水平降低，細胞核 p65 水平升高，且細胞核中 p-p65 水平顯著降低。此外，qPCR 檢測發現 CGG100 細胞中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等炎癥因子表達水平顯著降低，表明 p-p65 水平降低抑制了 NF-κB 通路活性，影響了炎癥反應相關基因的表達。
結果4：uN2CpolyG 與 p65 相互作用抑制其磷酸化
分子對接模擬顯示 p65 與 uN2CpolyG 有潛在相互作用，co-IP 實驗進一步證實了在 CGG100 細胞中 uN2CpolyG-GFP 和 p65 之間存在蛋白 - 蛋白相互作用。免疫熒光染色顯示，在 CGG100 細胞的細胞質和細胞核中，p65 與 uN2CpolyG-GFP 存在顯著共定位現象，轉染 CGG69 質粒的細胞中也有類似結果。這表明 NF-κB/p65 活性的降低與 uN2CpolyG 包涵體的存在密切相關，但對 NIID 發病的具體利弊仍有待確定。
結果5：降低 NF-κB 活性加劇 NIID 病理表型
用 NF-κB 激活劑（LPS）或抑制劑（curcumin）處理轉染了含 CGG100細胞發現，30μg/ml LPS 可降低 uN2CpolyG 產生、減少包涵體形成并提高細胞活力，而curcumin等抑制劑會加劇 NF-κB 抑制，增加 uN2CpolyG 水平并降低細胞活力。此外，siRNA 介導的 p65 敲低會導致 uN2CpolyG 聚集增加。在轉染 CGG69 細胞和 U87 細胞系中也得到了類似結果。這表明增強 NF-κB 活性可能改善 NIID 病理特征，而抑制其活性會使病情惡化。
結果6：降低 NF-κB 活性通過抑制自噬增加包涵體
在轉染的 CGG100 細胞中，雖然 mTOR 水平無明顯變化，但 p-AMPK 水平升高，表明細胞試圖啟動自噬。然而，隨著 p-p65/p65 比例降低，CGG100 相比 CGG9 細胞，Beclin 1 和 LC3II 水平顯著降低，溶酶體數量也減少，表明自噬通量受損，不溶性的 uN2CpolyG 水平增加。用 LPS 處理可增加 p-p65/p65 和 LC3II/LC3I 比例并減少 p62 水平，而自噬抑制劑 3-MA 可減弱 LPS 降低不溶性的 uN2CpolyG 水平的能力，Beclin 1 敲低會增加 uN2CpolyG 水平。轉染 CGG69 質粒的細胞中也觀察到類似現象，說明 NF-κB 活性降低可通過抑制自噬導致包涵體增加，兩者聯系緊密。
結果7：NF-κB 活性降低后 NLRP3 導致自噬減少
在 CGG100 細胞中，NF - κB 活性降低時，NLRP3 及下游蛋白表達顯著下降。LPS 處理可提升 p - p65/p65、NLRP3 和 LC3II/LC3I 水平，curcumin 處理則反之。敲低 p65 會使 NLRP3 水平和 LC3II/LC3I 比例降低。共聚焦顯微鏡和免疫熒光染色顯示 NLRP3 與 LC3B 在 CGG9 細胞中顯著共定位，而在 CGG100 細胞中觀察到極小的共定位。這說明NLRP3 炎性小體可能在 NID 個體 NF-κB 通路活性降低后的自噬功能障礙中發揮關鍵作用。
結果8：適當激活 NF-κB 改善果蠅 NIID 表型
在果蠅 NIID 模型中，轉基因果蠅出現運動能力下降、壽命縮短和腦內包涵體等癥狀。用不同濃度 LPS 處理后，發現 100μM LPS 在第 30 天可顯著改善運動能力，1μM LPS 可延長壽命并減少腦內包涵體數量，但 1mM LPS 會產生有害影響。這表明適當激活 NF-κB 對改善 NIID 表型有積極作用，與細胞實驗結果相互印證。
結論
本研究揭示了神經元核內包涵體病（NIID）的重要發病機制：uN2CpolyG 蛋白與 p65 結合，抑制 NF-κB-NLRP3 通路，使自噬關鍵蛋白減少，毒性蛋白積累，加速神經元死亡。不過，激活 NF-κB（如用 LPS）可減少包涵體、改善果蠅運動能力，為 NIID 藥物研發提供了方向，有望推動針對該病的治療取得新突破。
