2025-03-10
文章題目：A stepwise mode of TGFβ-SMAD signaling and DNA methylation regulates na?ve-to- primed pluripotency and differentiation
上海交通大學在《Nature Communications》上發表了TGFβ- SMAD信號和DNA甲基化的逐步模式調節原始到啟動的多能性和分化的研究成果，影響因子14.7。本研究中ATAC-seq檢測及部分數據分析工作均由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
01、研究背景
TGF-β信號通路在小鼠胚胎發育中扮演著重要的角色，包括胚胎模式建立，細胞命運確定和動態運動等，并且還影響胚胎干細胞的多能性和分化功能。經典的TGFβ信號傳導主要通過Smad2/3與Smad4形成的復合物激活下游的靶基因。然而，越來越多的研究表明，在某些情況下，Smad2/3可獨立于Smad4入核，并發揮調控作用。在小鼠胚胎發育早期，從上胚層中特異性敲除Smad4卻對于TGF-β掌控的上胚層的形成影響甚微。因此探究Smad2/3獨立于Smad4的調控機制尤為重要。
02、技術路線
03、研究內容
S2/3DKO和S4KO的的差異轉錄組分析
研究首先利用CRISPR/Cas9技術生成了Smad2/3雙敲除（S2/3DKO）和Smad4敲除（S4KO）的mESCs。轉錄組分析顯示S2/3DKO和S4KO之間存在明顯差異，S2/3DKO在基因表達上表現出更顯著的變化（圖1A-F）。基因集變異分析（GSVA）表明，S2/3DKO和S4KO對原始內胚層和植入后上胚層的決定具有不同影響。S2/3DKO促進原始內胚層的形成并抑制植入后上胚層基因的表達，而S4KO對這些過程的影響較溫和（圖1G-J）。
圖1 mESC分化過程中Smad2/3和Smad4的差異要求
在Smad4缺失情況下，外胚層（Epiblast）可以形成
作者將已建立的系統WT、S2/3DKO和S4KO的mESCs轉化為外胚層樣細胞（EpiLCs），結果發現WT和S4KO mESCs逐漸發生了典型的EpiLCs形態轉變，而S2/3DKO mESC保留mESC克隆形式（圖2A-B）。之后通過 ChIP-seq 和 CUT&Tag 技術，檢測 Smad2/3 和 Smad4 在基因啟動子和增強子上的結合情況。結果表明Smad2/3在促進從原始mESCs到啟動EpiLCs的轉變中的關鍵作用。Smad4作為TGF-β信號傳導的經典Smad2/3-Smad4復合物的一部分，在誘導中胚層調節因子中發揮次要作用（圖2C-E）。
圖2 Smad4缺失情況下的外胚層形成
Dnmt3b與Smad2/3互作
作者為了探索Smad2/3獨立調控外胚層基因的潛在機制，對來自WT和S4KO的D3 EBs進行了Smad2/3質譜共免疫沉淀(IP-MS)分析，結果發現Smad2/3 可以和 Dnmt3b 相互作用（圖3A-E）。在從初始多能性向誘導多能性轉變過程中，Smad2/3上調Dnmt3b，且這種上調對形成上胚層很重要。在野生型（WT）和S4KO細胞中敲低Dnmt3b會影響上胚層基因的表達，突顯了Dnmt3b在該過程中的重要性（圖3F-H）。
圖3 Dnmt3b與Smad2/3互作
Smad2/3上調Dnmt3b對外胚層形成至關重要
在mESC啟動過程中，Dnmt3b在S2/3DKO EBs中部分下調，但在S2/ 3/4TKO中大部分被阻斷。表明Smad2/3和Smad4都可以調節Dnmt3b的表達，但Smad2/3更占優勢，Smad2/3在mESC啟動過程中刺激Dnmt3b的表達，從而促進上皮細胞的形成。
圖4 Smad2/3上調Dnmt3b對外胚層形成非常重要
Dnmt3b獨立于Smad4介導Smad2/3與外胚層基因結合
作者用表達野生型Dnmt3b的慢病毒載體感染S4KO +Dnmt3b-sh2細胞(催化失活的Dnmt3b失去DNA甲基化能力)有效地挽救了Fgf5和T在S4KO+Dnmt3b-sh2 EBs中的表達，結果表明表明DNA甲基化和Dnmt3b的h3k36me2 /3關聯能力是激活S4KO引物外胚層基因所必需的。Dnmt3b能直接與Smad2/3互作并促進Smad2/3結合到上胚層順式作用元件中心的低甲基化區域。始發態細胞開始分化時，Dnmt3b 對全局基因組甲基化的參與減少，Smad4 接過接力棒，與 Smad2/3 形成復合物，支持中內胚層的誘導。
圖5 Dnmt3b獨立于Smad4介導Smad2/3與外胚層基因結合
04、研究結論
本研究通過RNA-seq、ChIP-seq、CUT&Tag、ATAC-seq、WGBS等分析揭示了Smad2/3在mESCs向EpiLCs轉變過程中通過誘導Dnmt3b表達來調控DNA甲基化模式，從而促進原始態多能性向始發態多能性的轉變。同時還揭示了在Smad2/3缺失情況下，Smad4單獨不能啟動Epiblast特異性基因轉錄。在分化過程中，Dnmt3b活性降低，Smad4與Smad2/3形成復合物，支持中胚層和內胚層的誘導。總之這項工作闡明了信號傳導和表觀遺傳的協同作用機制，進而為理解TGFβ信號在生理學和病理學中的作用提供了新的思路。
原文索引：Zhao B, Yu X, Shi J, Ma S, Li S, Shi H, Xia S, Ye Y, Zhang Y, Du Y, Wang Q. A stepwise mode of TGFβ-SMAD signaling and DNA methylation regulates na?ve-to-primed pluripotency and differentiation. Nat Commun. 2024 Nov 22;15(1):10123. doi: 10.1038/s41467-024-54433-5
