2023-11-23
單細胞測序技術是指獲取單個細胞遺傳信息的測序技術，即在單個細胞水平上，對基因組或轉錄組進行提取擴增和高通量測序分析，是探究細胞異質性的利器。斑馬魚作為研究器官發育或免疫調控的重要模式動物，是目前單細胞研究最多的水產生物，其單細胞研究也為其它水產生物奠定了基礎。今天我們就對近期發表的《Cell Reports》文章進行解析，看單細胞測序技術如何解析成年斑馬魚不同器官中巨噬細胞和樹突狀細胞的異質性。
1、研究背景 組織駐留巨噬細胞(TRM)和樹突狀細胞(DC)是天然免疫系統的重要組成部分，在免疫、組織發育、組織動態平衡和組織修復等方面發揮著關鍵作用。此外，巨噬細胞和樹突狀細胞在組成上也呈現出高度異質性。近年來，隨著單細胞組學技術的發展，各種組織和器官中均被鑒定出了不同類型的巨噬細胞和樹突狀細胞亞群。然而，目前對于這些不同組織和器官中的亞群細胞在發育和功能上的關系仍然知之甚少。由于其保守的造血系統以及各種遺傳工具和命運圖譜策略的可利用性，斑馬魚成為研究造血細胞（包括TRM和DC）發育的最佳模型系統。盡管斑馬魚巨噬細胞已經被廣泛地研究了各種報告系和缺陷系，然而，斑馬魚的TRM異質性和DC細胞的生物學特性在很大程度上仍不清楚。本研究利用單細胞轉錄組測序破譯成年斑馬魚中TRM和DC細胞的異質性，為進一步研究這些細胞的發育和功能特性提供了有價值的工具。
2、研究思路
3、研究結果 一、成年斑馬魚mpeg1.1+免疫細胞圖譜 為了系統性評估成年斑馬魚TRM和DC的異質性，本研究利用標記泛髓系細胞的轉基因斑馬魚品系Tg (mpeg1.1:DsRedx)，通過流式細胞分選富集了6個不同器官（3個屏障組織（表皮、鰓、腸）和3個內臟器官（肝、心臟和腦））中的mpeg1.1+細胞進行了單細胞轉錄組測序（圖1A）。分別對源于表皮：2,832鰓：3,711，腸：3,286；肝：3,248；心臟：3,679腦：2,842個高質量單細胞進行聚類分析，共注釋出8個細胞亞型（圖1B、1C）。本研究發現在所有的器官中均注釋出巨噬細胞和DC（圖1D）。 圖1 實驗設計和成年斑馬魚mpeg1.1+免疫細胞圖譜展示 二、mpeg1.1+免疫細胞群在各個器官中高度保守 接下來，本研究通過結合來自所有器官的mpeg1.1+細胞群進行比較分析，評估來自不同器官中相同細胞群體的轉錄模式的相似性。Pearson相關分析顯示，來自不同器官的相同細胞群通常高度相關（圖2A），結果表明每個細胞群體都有一個核心轉錄組特征，該特征定義了其身份并賦予了跨器官的特殊功能。為了確定不同細胞群體的核心轉錄組特征，本研究針對所有器官的細胞亞型進行了亞型間差異表達基因（DEG）分析，發現巨噬細胞上調與吞噬作用相關的基因，如fcer1gl，scarb2a, lgals3bpa等。此外，所有器官中的巨噬細胞和DC細胞顯示出保守的譜系特異性轉錄因子(Tf)的表達，如巨噬細胞中的cebpa和mafbb，以及DC中的id2a和znf366（圖2C）。它們是經過前期研究對巨噬細胞和DC細胞跨物種發育至關重要的調控因子。綜上所述，本研究定義了斑馬魚器官中不同mpeg1.1+免疫細胞群的核心轉錄組特征，并揭示了可能參與其發育的譜系特異性轉錄因子。 圖2 mpeg1.1+免疫細胞群跨器官特征分析 三、在屏障組織、肝臟和心臟中存在兩個功能不同的巨噬細胞亞群 為了進一步表征巨噬細胞的異質性，本研究提取了所有器官的巨噬細胞，并以更高的分辨率重新進行降維聚類，注釋出lgals3bpb+巨噬細胞和ccl34a4+巨噬細胞，它們在屏障組織、肝臟和心臟中具有不同的分布模式，與lgals3bpb+巨噬細胞不同，ccl34a4+巨噬細胞分別是肝臟中的主要巨噬細胞群和心臟中唯一的巨噬細胞群（圖3A、3B、3C）。亞型間差異表達基因（DEG）分析發現Lgals3bpb+巨噬細胞高水平表達與吞噬作用相關的基因，如lgas 13bpa等，表明其強大的吞噬功能。此外，Lgals3bpb+巨噬細胞高表達炎性趨化因子，如cxcl8a等，表明其具有促炎能力。這些數據表明，lgals3bpb+巨噬細胞具有較強的吞噬和免疫細胞募集能力，具有促炎作用。因此，本研究將lgals3bpb+巨噬細胞群定義為促炎巨噬細胞（pro-inflammatory macrophages）。另一方面，ccl34a4+巨噬細胞最顯著的特征是它們廣泛表達與組織重塑和再生有關的基因，如timp2b等。ccl34a4+巨噬細胞可能在正常器官發育和組織內穩態維持中發揮關鍵作用，故本研究將ccl34a4+巨噬細胞命名為促重塑巨噬細胞（pro-remodeling macrophages）（圖3D、3E、3F）。為了探索這兩個巨噬細胞亞群之間的譜系關系，本研究分析了兩個MP亞群在不同器官中轉錄因子的差異表達水平，結果發現這兩個群體差異表達了許多與巨噬細胞發育和功能特化相關的轉錄因子（圖3G）。綜上，這兩個功能不同的巨噬細胞亞群可能經歷了不同的發育途徑，受到不同的遺傳程序的調節。 圖3 跨器官的兩個不同功能的MP亞群的鑒定 四、斑馬魚體內cDCs和pDCs的存在 為了進一步表征樹突細胞的異質性，本研究提取了所有器官的樹突細胞，并以更高的分辨率重新進行降維聚類，注釋出cDCs細胞和pDCs細胞，在屏障組織、肝臟和心臟中，檢測到一個主要的cDC亞群，斑馬魚cDCs高表達ccl35(包括ccl35.1和ccl35.2)和核受體4a2b(Nr4a2b)基因，這些發現表明，斑馬魚cDCs可能作為抗原呈遞細胞發揮作用，并可能發揮重要的免疫調節作用。另一方面，斑馬魚pDCs明顯表達高水平的組織蛋白BB(Ctsbb)和嘌呤能受體p2x3a(P2rx3a)基因，表明它們在抗病毒應答中的專門作用（圖4A、4B、4C和4D）,綜上所述，這些結果表明斑馬魚在成體器官中擁有功能保守的cDCs和pDCs，它們構成了有效的免疫系統來應對各種病原體的入侵。 圖4 屏障組織、肝臟和心臟中cDCs和pDCs的鑒定 五、吞噬性小膠質細胞和調節性DCs存在于成年斑馬魚大腦中 本研究在成年斑馬魚大腦中鑒定了巨噬細胞、小膠質細胞和不同DC細胞群，包括cDCs和pDCs（圖5A）。作為大腦駐留的巨噬細胞，小膠質細胞在調節中樞神經系統（CNS）的發育和功能方面起著至關重要的作用，基因表達分析發現其特異性表達小鼠和人類小膠質細胞的標記基因，如p2ry12、apoeb、apoc1、sall3a和sall3b（圖5B），表明斑馬魚小膠質細胞具有進化保守的轉錄譜。與只有一個cDCs群的屏障組織、肝臟和心臟不同，大腦具有兩個不同的轉錄cDC亞群，cnn3a+cDCs和ccl35+cDCs（圖5C和5D），跨器官分析發現腦內ccl35+cDC亞群更像在其他五個器官中鑒定的常見ccl35+cDCs（圖5E）。與MHCII類相關基因表達較高的ccl35+cDCs相比，腦特異性cnn3a+cDCs表達哺乳動物cDC1標記基因，如xcr1a.1、hepaca2和batf3（圖5F），這表明其與ccl35+cDCs存在潛在的功能和譜系差異。綜上，本研究在斑馬魚腦中發現著一類組織特異的cDC細胞亞群，其高表達了與免疫調節和神經保護相關的基因，預示了這些細胞在中樞神經系統發育和免疫穩態維持中具有重要作用。 圖5 斑馬魚大腦中吞噬性小膠質細胞和調節性DCs的特性
4、研究總結 本研究系統性地解析了成年斑馬魚不同器官中巨噬細胞和樹突狀細胞的異質性，且基于這些不同巨噬細胞和樹突狀細胞亞群的標志基因，建立了多個特異性轉基因報告魚品系，為深入研究這些細胞亞群的發育和功能提供了有價值的工具和資源。
