2023-08-03
前言
眼睛、一個美麗而神奇的器官。
人類眼睛內部的眼球近似球狀，由眼球壁和眼內容物構成。人的眼球壁由外至內依次為纖維膜、血管膜、視網膜。角膜作為眼球壁組成部分，是彎曲度大于眼球外壁其他部分的透明圓盤狀結構；正常人角膜中央薄（約0.5mm）周邊厚（約1.0mm）；角膜由無血管的結締組織構成；含有豐富的神經末梢。
一、眼角膜結構簡介
人的角膜分為五層，由前向后依次為：角膜上皮(corneal epithelium)、前界層(anterior limiting lamina )、角膜基質（corneal stroma）、后界層( posterior limiting lamina )、角膜內皮(corneal endothelium)。
由于角膜的特殊構成，在解離過程中會出現細胞量較少且脆弱容易凋亡的情況。經過測試優化，小派提供一種高效、穩定的角膜組織解離方案，可獲得活性好、總量多、背景干凈的單細胞懸液。
二、解離方案
1、提前配制復合酶解離液（含木瓜蛋白酶、DNase Ⅰ等）及蛋白酶抑制劑。
2、從組織保存液中取出角膜組織樣本，放入預冷的 DPBS中清洗。
3、將清洗后的組織放到復合酶解離液中，用眼科剪將組織剪成碎片狀，轉移至含有剩余解離液的50ml離心管中，置于37℃水浴中震蕩消化 30-90 min，期間可使用巴氏吸管輕柔吹打組織，使其充分接觸解離液。
4、消化結束后，解離液通過 40um 細胞篩進行過濾，收集通過的細胞濾液至一新的無菌離心管中。
5、4℃，300 xg 離心 5 min，棄上清。向細胞沉淀中加入含蛋白酶抑制劑和DNaseⅠ的培養基重懸細胞，再通過低速離心，獲得背景干凈的細胞。
6、加入適量DPBS（含 2%FBS）重懸細胞，取20uL細胞懸液進行細胞計數和活力測定。（注：AOPI熒光計數、臺盼藍染色鏡檢）
三、結果展示
角膜組織
（注：新鮮組織短時間內取出，盡快放入到組織保存液，送到實驗室）
鏡檢結果
單細胞懸液背景干凈，細胞狀態好
活性、濃度檢測
細胞活性95%，濃度655個/ul，總量在15W以上。
數據質控
上圖是下機數據cellranger質控結果，細胞捕獲數及基因數都符合前期需求。
