2017-08-16
最新一期Clinical Cancer Research (IF: 9.619)上刊登了美國明尼蘇達大學研究團隊關于前列腺癌腫瘤標志物的最新研究成果，文章題為“Androgen receptor variant AR-V9 is co-expressed with AR-V7 in prostate cancer metastases and predicts abiraterone resistance”。該研究團隊采用PacBio全長轉錄本測序（Iso-Seq）的方法對前列腺癌化療的抗性標志物——雄激素受體變異體（AR-V）的轉錄本結構特征進行深入分析。雄激素受體（Androgen receptor，AR）是正常前列腺細胞以及前列腺癌細胞中最主要的轉錄調節因子。已有研究表明，雄激素受體AR-V7是不依賴配體的轉錄因子，會促進前列腺癌對AR靶向治療產生抗性，臨床上已將AR-V7作為一種生物標志物，并建立了監測和抑制AR-V7表達的方法。由于受二代測序讀長的限制，無法對完整的AR及AR轉錄本異構體進行準確定量，因此研究人員無法搞清楚是否有其它的AR變異體與AR-V7共同表達，從而促進對AR靶向治療的抗性。為了解決這個瓶頸，明尼蘇達大學的研究團隊采用PacBio 單分子測序技術，無需片段化、無需組裝，直接對全長轉錄本進行測序，確定了完整的AR及AR轉錄本異構體的外顯子結構，并估算了它們的豐度。作者發現AR-V7和AR-V9通常在前列腺癌晚期患者中發生共表達，并且還發現，先前認為僅存在于AR-V7中的與可變剪切有關的外顯子，同樣存在于AR-V9 mRNA中。研究人員重新注釋了AR-V9 mRNA的結構，并進一步明確了AR-V9 mRNA的高表達可作為預測前列腺癌對靶向藥物醋酸阿比特龍發生抗性的生物標志物。
實驗流程：
實驗結果
1. AR-V7和AR-V9在前列腺癌細胞共表達
AR典型外顯子1-8表達結果和預期的一樣，外顯子3下游部分高表達，包括CE3和CE5(圖1)。AR-V與AR mRNA相比缺少配體結合域(LBD)。
圖1 CPRC中AR基因結果
2. AR-V7和AR-V9 3’端外顯子結構分析
三代測序完善了AR基因的外顯子結構(圖3)，此外，不同的引物測序所得的外顯子信息完整性不同。
圖2 CPRC中不同AR亞型的基因結構
3. AR-V7和AR-V9在CPRC共表達
圖3A是56位CPRC陽性病人轉移灶活檢結果。圖3B是12位接受阿比特龍或恩扎魯胺治療的病人的腫瘤循環細胞中AR-V7和AR-V9情況。結果表明，AR陽性病人AR調控及前列腺癌相關基因都有一定的表達。部分病人往往存在AR-V7和AR-V9共表達現象。
圖3 AR-V7和AR-V9在CPRC共表達
4. 外顯子CE3 siRNA抑制AR-V9蛋白表達
圖4A顯示不同的剪切方式形成了不同的AR變異體，但是AR-V7和AR-V9之間存在overlap。siRNA(CE3或CE5)轉染22Rv1和VcaP細胞，提取RNA后進行RT-PCR，圖4B結果表明，轉染CE3 siRNA細胞的AR-V7和AR-V9表達量都有所降低，而CE5 siRNA只影響了細胞中AR-V9的表達量。轉染后細胞的免疫沉淀結果和RT-PCR結果一致。
圖4 AR-V7和AR-V9 3’UTR存在overlap
5. AR-V9激活并促進AR合成
慢病毒感染和細胞增殖實驗結果表明，AR-V9可促進CPRC細胞的AR非依賴性增殖，也就是說，如果在CPRC的循環腫瘤細胞中檢測到了AR-V9的話，那么這可能與患者對Enzalutamide存在耐藥性。
圖5 AR-V9作為AR的激活轉錄因子
2016年，派森諾生物在原有的PacBio RS II三代高通量測序儀基礎上，率先部署最新款PacBio Sequel測序儀，并已投入使用，助力全長轉錄組測序研究！
參考文獻
Kohli M, Ho Y, Hillman D W, et al. Androgen receptor variant AR-V9 is co-expressed with AR-V7 in prostate cancer metastases and predicts abiraterone resistance[J]. Clinical Cancer Research 2017.
