2017-08-23
在類人猿和人類的進化過程中，松弛素基因經過復制，形成了兩個序列高度相似松弛素基因，RLN1和RLN2基因。高度同源的RLN1和RLN2基因的同步表達不利于對其進行精準描述。澳大利亞前列腺癌研究中心Colleen Nelson教授研究團隊利用Pacbio SMRT和RNA-seq對LNCaP細胞系進行測序，來解析RLN1和RLN2的變異體的表達。文中鑒定了一種新的融合轉錄本，其中包含有RLN1和RLN2基因，同時發現他們在正常組織和前列腺癌組織中都有表達。融合基因的鑒定提供了用以確定RLN1-RLN2融合基因和RLN1的單拷貝區域的信息。RLN1-RLN2融合基因和RLN1在LNCaP細胞中共表達，但是這兩個基因產物被雄激素負調控。這個發現對松弛素領域的研究進行了更新，也激勵對RLN1和RLN2在PCa 細胞系中作用的進一步研究。
將環狀一致性序列（CCSs）比對到RLN1-RLN2位點，發現CCSs能比對到已注釋的RLN1基因，卻不能比對到已注釋的RLN2基因。兩個較長的RLN2轉錄本的變異體和RLN1基因融合，形成了兩個融合基因RLN1-RLN2-1和RLN1-RLN2-2（圖1）。
圖1 利用SMRT測序識別LNCaP細胞中的RLN1-RLN2融合基因
新RLN1-RLN2融合基因包含RLN1和RLN2的部分核苷酸序列，并獲得了基因間區的新外顯子。較短的RLN1-RLN2-1融合基因轉錄為RLN2肽，不考慮對其做深入研究。較長的RLN1-RLN2-2融合基因預測是一個新RLN2異構體，這個融合基因包含有可選擇的起始密碼子和新的外顯子（圖2）。新的RLN2異構體包含有完整的RLN2的功能域（B-chain，C-肽和A-chain），但是丟失了整個的信號序列，這對于內質網-高爾基體途徑中的分泌過程是必要的。
圖2 RLN1-RLN2-2融合編碼一個假定的沒有信號肽的RLN2異構體。
RLN1-RLN2-2融合基因和已注釋的RLN1和RLN2基因有明顯的重疊區。利用BLAT工具和USCS基因組瀏覽器比對新融合基因，在RLN1-RLN2-2單拷貝區域設計qPCR引物。設計RLN1-RLN2-2融合基因的特異性正向引物，需跨越融合的新外顯子和下游的融合外顯子的結合位點。在RLN2和RLN1-RLN2-2融合基因的共有區域設計反向引物（圖3A）。同理設計RLN1的qPCR引物。為了檢測引物的特異性，用多四環素誘導的慢病毒載體轉染LNCaP細胞系，其編碼以注釋的RLN2為靶基因的shRNA（shRLN2）。對照是編碼非靶基因的shRNA（shNT）LNCaP細胞系。多四環素的處理，對shNT細胞系中RLN1-RLN2-2融合基因的表達沒有影響，但是在shRLN2細胞系中引起RLN1-RLN2-2融合基因的顯著減少（圖3B）。另外，多四環素處理減少了RLN1的表達，但是在shNT和shRLN1細胞系之間沒有差異，可以證明RLN1引物的特異性（圖3C）。
圖3 鑒定識別RLN1-RLN2-2融合和RLN1的單拷貝序列。
RLN1-RLN2-2融合基因和RLN1在轉錄本的同一鏈上有重疊區（圖1）。預測RLN1和RLN1-RLN2-2融合基因的表達有關聯。首先檢測RLN1在3個正常組織和7個PCa細胞系中的表達量。發現RLN1只在LNCaP細胞系中大量表達，但是在其他PCa細胞中，表達差異減少了80倍（圖4A）。同時發現，RLN1-RLN2-2融合基因在LNCaP細胞系中高表達，在其他PCa細胞系中是低表達（圖4B）。利用 GeneAtlas芯片數據分析進一步發現前例腺組織中RLN1特異性表達（圖4C）。另外，使用TCGA公共的RNA-seq數據，研究正常組織和PCa組織樣本以確認RLN1的表達是否受正常前列腺組織的限制，發現正常組織和PCa組織高表達RLN1（圖4D）。
圖4 RLN1和RLN1-RLN2-2融合的共表達及PCa細胞系中RLN1表達的不具代表性
用胎牛血清（CSS）代替雄激素培養LNCaP細胞系10天，發現缺少雄激素導致RLN1-RLN2-2融合基因水平保持穩定增長（圖5A）。在缺少雄激素的情況下，RLN1的水平也比較高，但是和RLN1-RLN2-2融合基因相比，這種增長是微量的。 為了驗證RLN1-RLN2-2融合基因的表達的增加是雄激素導致的，設計了相似的實驗。將LNCaP細胞系先在CSS中培養2天，然后用雄激素處理2天。處理后的LNCaP細胞系中限制了RLN1-RLN2-2融合基因表達（圖5B）。雄激素處理細胞系和對照相比，雄激素抑制作用導致了RLN1-RLN2-2融合基因水平降低了60-75%。和RLN1-RLN2-2基因相反，雄激素的處理導致RLN1表達上調，表明雄激素對基因的逆調控作用（圖5C）。 為了確認RLN1-RLN2-2和RLN1與雄激素的逆調控作用是由于雄激素的信號傳導作用，特定地使用多四環素抑制AR，誘導shRNA敲除（shAR）。在多環素誘導和非誘導細胞系中，對照細胞系（shNT）DHT處理抑制RLN1-RLN2-2融合（圖5D）。抑制作用在非誘導shAR細胞系中很明顯，但是多環素誘導AR敲除改善了這種抑制作用，證明雄性激素信號傳導下調RLN1-RLN2-2的水平（圖5D）。和RLN1-RLN2-2相反，RLN1的表達在DHT處理的對照細胞系中增加，但是這種增加是受AR敲除的抑制（圖5E）。
圖5 RLN1-RLN2-2和RLN1受雄激素的負調控作用。
文章目的是通過SMRT平臺對PCa LNCaP細胞系中全長RNA轉錄本進行測序，用以詳細解析RLN1，RLN2及它們的轉錄本變異體的表達，鑒定RLN1和RLN2的單拷貝序列，進而對它們進行更精準的描述。研究發現了一種新的高表達的融合基因，包含有RLN1和RLN2基因，推測編碼一個RLN2異構體，導致信號序列區域被改變，可能會改變細胞分泌方式。
參考文獻
Tevz G, McGrath S, Demeter R, et al. Identification of a novel fusion transcript between human relaxin-1 (RLN1) and human relaxin-2 (RLN2) in prostate cancer[J]. Molecular and cellular endocrinology, 2016, 420: 159-168.
