2020-02-24
2019年12月(yue)初(chu)，在我國武漢(han)地區流行(xing)一(yi)種(zhong)(zhong)以(yi)(yi)發熱、肺部感染為(wei)癥(zheng)狀的傳染性疾(ji)病(bing)，繼(ji)(ji)而(er)肆虐全(quan)國，全(quan)國各地甚至(zhi)國外相繼(ji)(ji)報(bao)道出現這種(zhong)(zhong)疫情。這種(zhong)(zhong)疾(ji)病(bing)的癥(zheng)狀不(bu)同于典型肺炎(yan)，且對常規抗菌治(zhi)療無效，也未鑒定出已知的引(yin)起肺炎(yan)的細菌或病(bing)毒等病(bing)原體(ti)。2020年1月(yue)，各類專家通過高通量測序證(zheng)實本次武漢(han)流行(xing)的不(bu)明原因肺炎(yan)的病(bing)原體(ti)為(wei)一(yi)種(zhong)(zhong)以(yi)(yi)前未知的β屬(shu)冠狀病(bing)毒（見(jian)圖(tu)1）。
圖1
2019-nCoV基因組序(xu)列已通過測序(xu)解析完成，結果(guo)顯示基因組含有約29000個(ge)堿(jian)基，有12個(ge)蛋白編(bian)碼區/開放讀碼框（ORF）（見圖2），包括1ab、S、3、E、M、7、8、9、10b、N、13、14；與蝙(bian)蝠SARS樣冠(guan)狀(zhuang)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)bat-SL-CoVZC45、bat-SL-CoVZXC21和人SARS冠(guan)狀(zhuang)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)SARS-CoV 3種(zhong)(zhong)冠(guan)狀(zhuang)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)相(xiang)應(ying)蛋(dan)白質(zhi)的(de)長度非常相(xiang)近；其中ORF 1ab為(wei)RNA依賴(lai)的(de)RNA聚合(he)酶(mei)(mei)基因(yin)(yin)（RdRp）所在(zai)區(qu)域，編碼(ma)RNA聚合(he)酶(mei)(mei)，負(fu)責病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)核(he)酸復制；S區(qu)編碼(ma)棘突蛋(dan)白，與病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)感(gan)染能力相(xiang)關，通過與細胞(bao)表(biao)面血管緊張素(su)轉換酶(mei)(mei)2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受體結合(he)進入宿(su)主細胞(bao)；E區(qu)編碼(ma)囊膜(mo)(mo)蛋(dan)白，負(fu)責病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)包膜(mo)(mo)及(ji)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)顆粒的(de)形成；M區(qu)編碼(ma)膜(mo)(mo)蛋(dan)白；N區(qu)編碼(ma)核(he)殼蛋(dan)白，與病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)基因(yin)(yin)組(zu)宿(su)主RNA互相(xiang)識別(bie)。由于(yu)2019-nCoV的(de)RdRp基因(yin)(yin)在(zai)進化樹上與SARS-CoV的(de)RdRp基因(yin)(yin)顯著不同，故被列為(wei)一種(zhong)(zhong)新的(de)β屬冠(guan)狀(zhuang)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。因(yin)(yin)而，RdRp基因(yin)(yin)也(ye)成為(wei)鑒定2019-nCoV核(he)酸的(de)一個重要(yao)標志物。
圖2
中國軍(jun)網北京(jing)1月29日電(dian)（特約記(ji)(ji)者莊(zhuang)穎娜 、記(ji)(ji)者邵龍飛(fei)），1月28日由(you)中國(guo)人民解放軍軍事(shi)科學院軍事(shi)醫(yi)學研究院與圣湘生物科技有限公司共同研制的(de)新(xin)型(xing)冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測試劑(ji)盒（RT-PCR熒光探針法）通過國(guo)家藥(yao)品監(jian)督(du)管(guan)理局(ju)應(ying)急審批，獲(huo)得醫(yi)療器械注冊證書。該(gai)檢測試劑(ji)基于新(xin)發布的(de)新(xin)型(xing)冠狀病毒（2019-nCoV）基因序列信息，融合熒光定量探針檢測的原理，針對其特異性基因序列進行了雙靶標基因設計。主要(yao)針(zhen)對(dui)新型冠狀病毒基因(yin)組(zu)中開放讀碼(ma)框(kuang)1ab（open reading frame 1ab ， ORF1ab ） 和 核(he) 殼 蛋 白 （ nucleocapsid protein，N）。N基因(yin)區域的(de)引物和特異性(xing)探針。
靶標一（ORF1ab）:
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
靶標二（N）:
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
核酸提取(qu)和(he)實時熒光RT-PCR反應體系及反應條件參考相關廠家(jia)試劑(ji)盒說(shuo)明。
結果判斷 陰性:無Ct值或Ct≥40。 陽性：Ct值(zhi)<37，可報告為陽性。
灰度區：Ct值在37-40之間，建議重復實驗，若重做結果Ct值<40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性,否則為陰性。在實驗室要確認一個病例為陽性，滿足以下條件： 同一份標本中新型冠狀病毒2個靶標（ORF1ab、N）特異性實時熒光RT-PCR檢測結果均為陽性。
為什么探針熒光RT-PCR法，很快成為該病毒高效、便捷的檢測方法呢？
往(wang)下看！往(wang)下看！往(wang)下看！
一、基本原理
1、熒光定量(liang)PCR原理：是通過或標記的特異性探針，對PCR產物進行(xing)標記跟(gen)蹤，反(fan)(fan)應(ying)過程。隨著PCR 反(fan)(fan)應(ying)的進(jin)行，反(fan)(fan)應(ying)產物不斷累積(ji)，熒光信號(hao)強度也(ye)等比例增加。每經(jing)過一(yi)個循環，收集一(yi)次信號(hao)，這樣就可以通過熒光強度變化(hua)監(jian)測產物量的(de)(de)變化(hua)，結合相應的(de)(de)軟件對產物進行分析，可以得到熒光擴(kuo)增曲線，計(ji)算待測樣品初(chu)始(shi)模版的(de)(de)量。技(ji)(ji)術(shu)是一次由定性技(ji)(ji)術(shu)向定量(liang)技(ji)(ji)術(shu)的飛躍(yue)，運用該項技(ji)(ji)術(shu)，可(ke)以對(dui)DNA、RNA樣品進行、絕對定量和。
圖(tu)3
2、TaqMan 熒光探針是一(yi)種寡核苷酸探針，熒光基(ji)團連接(jie)在探針的5`末(mo)端，而淬滅劑(ji)則在(zai)3`末端。PCR擴增時(shi)在加入(ru)一對(dui)引(yin)物的同時(shi)加入(ru)一個特異性(xing)的熒(ying)光(guang)探針(zhen)，探針(zhen)完整(zheng)時(shi)，報告(gao)基(ji)團發射的熒(ying)光(guang)信號被淬滅基(ji)團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切(qie)酶活(huo)性將探針(zhen)酶切(qie)降解，使報告熒(ying)光(guang)基(ji)團和淬滅熒(ying)光(guang)基(ji)團分離(li)，從而熒(ying)光(guang)監測系統可接(jie)收到熒(ying)光(guang)信號。
圖4
二、主要(yao)特點
與染料(liao)法相比(bi)具有(you)更低(di)的背景(jing)信(xin)號，更高的靈敏度，可以(yi)檢測(ce)低(di)于10個分子的(de)模板，更高的(de)特異性，結果(guo)也更準(zhun)確。同時也具有染料法的(de)操(cao)作(zuo)簡單，不影(ying)響酶(mei)促反應，耗時短(duan)（新(xin)冠肺炎病(bing)毒檢測需5-6h就可以出結果(guo)，快的測序也要48h）等(deng)優點。
三、范圍廣
探針(zhen)在流式細胞技(ji)術、免疫學、實時定(ding)量PCR技(ji)術、細胞調亡(wang)檢測及(ji)腫瘤細胞的識別中能應用(yong)。
為什么熒光定量探針法(fa)在醫學領域能(neng)穩(wen)(wen)穩(wen)(wen)的站得住腳(jiao)呢，向上看！向上看！向上看！
但是在方便的(de)同時，前期的(de)研(yan)發，調試等繁瑣(suo)的(de)工作，是由奮(fen)戰在前的(de)前輩們經過(guo)日(ri)日(ri)夜夜勞動得到(dao)的(de)成果，向(xiang)他們致敬！
為了向科研人(ren)(ren)員致敬，接(jie)下來派森諾將(jiang)接(jie)替前期繁瑣(suo)的工作，給科研人(ren)(ren)員更多的時間(jian)去思(si)考。
派森諾新型TaqMan-MGB探針服(fu)務
新型TaqMan-MGB探針技術可以進行基因定量分析，亦可分析基因突變（SNP）。TaqMan-MGB探針與普通TaqMan熒光探針相比具有更短的序列和更高的序列特異性，常被用于SNP分型的研究中。
派(pai)森諾的優(you)勢
派森諾有自主的合(he)成(cheng)(cheng)平(ping)臺一次合(he)成(cheng)(cheng)及(ji)二次合(he)成(cheng)(cheng)速度快(kuai)
一(yi)周(zhou)可以拿到引物(wu)、探針及各個環節實驗(yan)條件和(he)參數
減少您(nin)摸索的(de)時間及多次摸索產生(sheng)的(de)花費(fei)
資深博士跟蹤(zong)為您提供(gong)有(you)價值的建議
派森諾的服務內容
內容 | 熒光定量引物(wu)、探針 | TaqMan-MGB探針（多用于(yu)SNP、miRNA） |
服務周期 | 7個工作日 | 3～4周(zhou) |
公司交付(fu)結(jie)果(guo) | 引物、探針成品 | 引物、探針成品(pin) |
質粒標(biao)準品 | 質粒(li)標準(zhun)品 | |
實驗(yan)條(tiao)件(jian)及電泳圖 | 實驗(yan)條件及電(dian)泳圖(tu) | |
調試(shi)后(hou)的熒(ying)光定量結(jie)果(guo) | 調(diao)試后的熒(ying)光定量結果 | |
客戶提供信(xin)息 | 基因名稱及登錄號 | 基因名稱 |
基因種屬 | 基因種屬(shu) | |
實驗的目(mu)的及要求 | 實驗的目的及要求(qiu) | |
TaqMan探針的標記(ji)種類(lei) | 默(mo)認為(wei)TaqMan-MGB探針 |
派森諾(nuo)的要求
客戶提供(gong)不少(shao)于5ug的DNA or cDNA，作為調試模板。若(ruo)(ruo)不(bu)提供(gong)模(mo)板，公(gong)司進行(xing)調試，但不(bu)受理售后問題；若(ruo)(ruo)客戶提供(gong)模(mo)板，調試后，不(bu)出結果或(huo)者CT值很大，我(wo)們(men)會(hui)告(gao)知，若不(bu)再繼續(xu)，那(nei)么實驗終止；若選擇用我(wo)們(men)的模板進(jin)行調(diao)試，引物調(diao)試正常后(hou)，發貨，不(bu)受理售后(hou)問(wen)題。
派森諾服(fu)務宗旨
把(ba)繁瑣的(de)實驗交給我們，還你清晰透明的(de)實驗方案。
