2018-06-13
什么是基因組survey？
基因組survey：即基因組大小和復雜程度的調研，基因組大小是指單倍體細胞核中的所含的DNA的總量。常用的估計基因組大小的方法有兩種：
其一是流式細胞法，該方法用DNA含量衡量不同物種基因組的大小，基因組的大小通常用“C-value”來表示，也有用“pg”（皮克）單位來表示，1pg=10-12g，另外也有用“堿基對”來表示，例如1Mb=106bases，之間的直接換算關系是1 pg = 978 Mb或者1 Mb = 1.022 × 10-3 pg，流式細胞法是通過DNA熒光染料對分選后的細胞進行染色，然后和已知DNA含量的商品化標準品比對，得到檢測物種的DNA含量，進而通過上面的換算關系推測出基因組大小。
其二是高通量測序法，即對沒有參考基因組序列的物種，進行小片段低深度測序，以較低的成本基于K-mer分析去預估基因組的大小、雜合度及重復序列等信息。該結果可進一步指導后續的建庫策略和測序數據量，此外這次測序的數據還可用于后續基因組的拼接與拼接結果的校正。今天小編重點向大家介紹基于高通量測序的方法估計基因組大小、雜合度及重復序列。
基于K-mer評估基因組大小的原理
假設reads的長度為L，基因組大小為G，總的reads數目N，kmer長度為K，即將長度L的reads打斷成K長度kmer片段且kmer每次延伸1bp，則該條read會被打斷為L-K+1個kmer，例如：當K=17，reads長度L=100的時候，一共可以產生100-17+1個kmer片段。
根據Lander-Waterman模型，Kdepth = N*(L-K+1)/G，Knum = (L-K+1)*N (Kdepth為kmer的期望深度，kmer深度頻率分布遵循泊松分布，可以將深度分布曲線的峰值作為期望深度。Knum為從reads得到kmer的總數目），則基因組大小G=Knum/Kdepth，K的選擇和測序深度會對基因組估計大小產生影響，短片段插入庫數據深度不用過低或過高。
基因組大小估計結果解讀
了解完原理接下來我們就利用基因組survey的一款軟件Jellyfish來統計K-mer depth及頻數，統計結果用于畫K-mer分布圖及基因組特征的評估。K-mer 深度分布曲線屬于標準的泊松分布曲線，該曲線的形態受到以下幾個因素的影響：測序錯誤率、基因組的雜合度和重復序列。以一個雜合度較高的物種的 K-mer 分布圖為示例圖圖1：
圖1 Kmer分布示意圖
注：最左邊的峰為測序錯誤峰；第二個峰為雜合峰，如果基因組雜合度比較低，則不會出現該峰；第三個峰為純合峰，雜合峰的峰值所在位置一般為純合峰所在位置的一半，基因組的雜合度越高，則雜合峰與純合峰的比值越大；第四個峰為重復序列峰，在純合峰值所在位置的兩倍以上，重復序列越高，重復峰所占面積越大。
測序錯誤峰：當某個堿基發生測序錯誤后，將其reads打斷成長度K的kmer后，會將錯誤的kmer數量放大，這些kmer出現頻率較低，在Depth較低時會出現較高的錯誤峰，用于評估測序錯誤率。
純合峰：c值即為公式中的Kdepth用于評估基因組大小。
雜合峰：用于評估基因組雜合度。具體解釋為：假設純合的GTA在Kmer中出現了a次即深度a，而雜合GTA中T為T/A，則就會形成GTA/GAA兩種kmer，則每種對應就會平均出現a/2次即深度為a/2。
Repeat region：用于評估基因組重復序列比例，若出現兩個主峰，峰高相差不大且橫坐標是2倍關系，則為高雜合或高重復。
以某動物為例，PE400文庫Hiseq平臺測105G數據量，使用軟件Jellyfish設置K=17，得到95,767,623,756個kmer，純合峰對應的Kmer深度為118，最終估計出基因組大小約為812M，Kmer分布圖見下圖2。
圖2 某動物Kmer分布示意圖
動植物基因組推出的基因組survey項目，分析內容包括：
l 原始數據質控；
l 樣本質量分析：物種污染評估；
l 基因組評估：基因組大小、雜合度、重復序列比例評估等。測序數據也可以在后續做基因組拼接和校正時再次利用哦。
