2018-06-08
MutMap方(fang)(fang)法(fa)作為一種特殊(shu)的(de)BSA方(fang)(fang)法(fa)，其主要(yao)思路是(shi)：用(yong)化學誘變(bian)(bian)(bian)劑EMS處(chu)理(li)得(de)到(dao)突(tu)變(bian)(bian)(bian)體(ti)，然(ran)后(hou)用(yong)突(tu)變(bian)(bian)(bian)體(ti)植株(zhu)與野生型(xing)親(qin)本雜交得(de)到(dao)F2代(dai)，從F2代(dai)中挑選突(tu)變(bian)(bian)(bian)表型(xing)的(de)個體(ti)進行混池測序。定位(wei)(wei)的(de)方(fang)(fang)法(fa)是(shi)將(jiang)測序得(de)到(dao)的(de)reads比(bi)對到(dao)親(qin)本基(ji)因組上(shang)，計(ji)算SNP-index。突(tu)變(bian)(bian)(bian)體(ti)子代(dai)是(shi)所研究性狀(zhuang)突(tu)變(bian)(bian)(bian)位(wei)(wei)點的(de)純合個體(ti)，因此SNP-index = 1。而其他(ta)與性狀(zhuang)無關(guan)的(de)SNP位(wei)(wei)點，SNP-index ≈ 0.5。而與突(tu)變(bian)(bian)(bian)位(wei)(wei)點鄰(lin)近的(de)SNP位(wei)(wei)點，由于(yu)連鎖效(xiao)應(ying)，SNP-index也(ye)會增(zeng)加，即＞0.5 ，從SNP-index圖(tu)上(shang)看則會呈現(xian)一個峰，性狀(zhuang)相關(guan)候選基(ji)因就位(wei)(wei)于(yu)該區域(yu)內。
對于上述mutmap方法基(ji)因定(ding)位過程，常見路(lu)線是對野生(sheng)型(xing)親本和突(tu)變F2子(zi)代混池(chi)進行測(ce)(ce)序。實際項目中，某些情(qing)況下，我們會推薦測(ce)(ce)野生(sheng)型(xing)子(zi)代混池(chi)。那么對于野生(sheng)型(xing)F2子(zi)代混池(chi)是否有必要測(ce)(ce)序，加測(ce)(ce)野生(sheng)型(xing)子(zi)代對定(ding)位結果影響如(ru)何(he)呢(ni)？下面我們分別(bie)從理論上和實際的項目結果來說明這(zhe)個問題(ti)：
首先(xian)，對于EMS誘(you)變的(de)(de)植(zhi)株，SNP包(bao)含兩類(lei)(lei)，普通(tong)SNP和(he)(he)誘(you)變產生的(de)(de)SNP，以玉米（基因(yin)組(zu)2G）為例，兩類(lei)(lei)突變的(de)(de)頻率和(he)(he)數量分別為：
* 普通SNP： 突變頻率 1x10-3 數量2M SNP
EMS誘(you)變： 突變頻率 5x10-6 數量 10k SNP
可以看出，普(pu)通SNP比(bi)EMS誘(you)變產生的(de)SNP數(shu)目要多得(de)多，即使普(pu)通SNP有1%的(de)假陽性或假陰性，也(ye)會有20k的(de)SNP，數(shu)目也(ye)是(shi)EMS誘(you)變SNP數(shu)的(de)兩倍。因此，對(dui)于mutmap類項目，這些普(pu)通的(de)SNP作為與性狀無(wu)關(guan)的(de)背景噪(zao)音，對(dui)定位(wei)結果的(de)影響會更大，我們期望(wang)的(de)信(xin)號(hao)位(wei)點可能(neng)會被(bei)背景噪(zao)音所淹沒。
那么，我們如(ru)何降低背景(jing)噪音(yin)的(de)影響呢(ni)？除了通過(guo)我們常規的(de)過(guo)濾(lv)手段(duan)，保證獲得的(de)SNP的(de)準(zhun)確性和可靠性之(zhi)外，可以加測與突變體遺傳背景(jing)相同(tong)的(de)野生型子代(dai)混池的(de)手段(duan)。
下面我(wo)們通(tong)過(guo)實例對于是否測野生子代池(chi)的結果做一個比(bi)較。
研究物種(zhong)：某植物
測序(xu)平臺：Illumina HiSeq
測序(xu)策略：野生(sheng)親本20x ; 突變子代混(hun)池30x ; 野生(sheng)型(xing)子代混(hun)池 50x
混(hun)池樣本數：100株(zhu)
（A圖(tu)為突變(bian)子代(dai)混池SNPindex，B圖(tu)為野生型子代(dai)混池SNPindex，D圖(tu)為Delta-SNPindex）
我們以1號和2號染色體為例，若只測(ce)野生型(xing)親本和突變子代混池，則(ze)我們只得(de)到(dao)突變子代池的(de)SNPindex圖，即圖A，從圖中我們可以看出有多個峰(feng)，均會作為候選(xuan)區域做(zuo)后續分析。
若加測野生型(xing)子(zi)代池，則(ze)會得到野生型(xing)子(zi)代池的(de)(de)SNPindex，即(ji)B圖(tu)，兩者相減，可以(yi)(yi)得到Delta-SNPindex，即(ji)D圖(tu)。從結(jie)果可以(yi)(yi)看到，多個(ge)噪音峰(feng)值被消除，最終位于(yu)2號染(ran)色(se)體頭部的(de)(de)候選(xuan)區域會被篩選(xuan)出來(lai)。
所以(yi)(yi)，對(dui)于(yu)mutmap項目(mu)，從分析角度講(jiang)，只測野(ye)生(sheng)親(qin)本和(he)子代突(tu)變(bian)混(hun)池(chi)(chi)是可以(yi)(yi)的(de)，但(dan)會包(bao)含假(jia)陽性結(jie)果，具體影響(xiang)程(cheng)度與不(bu)同(tong)物種及測序情況有(you)關。若加測野(ye)生(sheng)型(xing)子代混(hun)池(chi)(chi)會改善定位結(jie)果。對(dui)于(yu)基(ji)因組比(bi)較大(da)、比(bi)較復(fu)雜的(de)物種，推薦大(da)家(jia)加測野(ye)生(sheng)型(xing)突(tu)變(bian)混(hun)池(chi)(chi)。
