2018-02-23
對于土壤微生態系統而言，通過功能基因對微生物群落進行擴增子測序分析，是探討土壤微生態作用機制的常用方法。最近，派森諾生物再次與石河子大學合作，在《Science of the Total Environment》（影響因子4.900）上發表文章，揭示化學和有機肥料的使用對滴灌石灰土中N2O氣體排放和反硝化細菌群落的作用。
1 研究背景
N2O是一種強效的溫室氣體，破壞臭氧層。大氣層N2O的含量的增加很大程度上和農業耕作方式相關。大約58%的人為N2O的排放來自于農業，在2030年很可能會因為N肥和動物肥料的施用N2O含量提升35-60%。反硝化作用是形成N2O的主要生物地球化學途徑，這個過程被4種關鍵酶催化：硝酸還原酶（NAR），亞硝酸還原酶（NIR），一氧化氮還原酶（NOR）和一氧化二氮還原酶（NOS）。編碼NIR和NOS的基因往往會通過相應的功能基因來分析反硝化菌群。
本文研究目的是為了確認不同施肥方式引起的土壤參數變化和反硝化菌群之間的潛在聯系。以滴灌棉花產業系統中石灰土為材料，連續4年施用化學肥料或者化學肥料加有機肥，從而比較化學肥料和混合有化學肥料的有機肥料對N2O通量的影響，并探究有機肥混合化學肥料如何影響土壤反硝化細菌的豐度，群落組成結構和多樣性，揭示N2O產生、反硝化細菌基因群落豐度和土壤物理化學性質之間的關聯關系。
2 研究方法
測序技術：Roche 454 FLX平臺
測序模式：nirK、nirS和nosZ功能基因測序
實驗設計：
| 實驗對象 | 處理方式 | 組名 | 樣品數 |
滴灌石灰土 | 未施肥 | CK | 3 |
化學肥料施肥 | CF | 3 | |
60% 化學肥料+牛糞 | COM | 3 | |
60% 化學肥料+生物肥料 | CBF | 3 |
3、研究結果
3.1 土壤中N2O通量
數據分析發現，施肥方式顯著影響土壤中N2O的通量（圖1）。按照N2O平均通量逐漸下降的順序進行排序發現：CF>COM>CBF>CK。土壤中N2O通量通常在灌溉施肥后的前3-4天增加，隨后就會減少。CF中平均最大N2O排放量比COM和CBF分別高了29.1%和40.1%。同時發現N2O通量在CF中比COM和CBF減少更快。結果表明N2O通量在施肥后急劇變化，有機改良劑降低了N2O排放的峰值，但是隨著時間推移會釋放更多N2O。
圖1 棉花種植期間不同施肥模式下N2O通量統計圖
3.2 累積的N2O排放和N2O排放系數
和未施肥組相比，CF,COM和CBF處理組中累積的N2O排放是顯著偏高的（圖2）。CF組中累積的N2O排放要比COM和CBF處理組高3.65%和8.29%。排放系數（EF）值在CBF中要明顯比CF和COM組中要小，表明生物肥料減緩土壤中N2O排放，但是會比有機肥排放的更多。
圖2 不同施肥模式下土壤N2O排放和N2O排放系數
3.3 反消化酶活性
施肥組相比CK組，明顯增強了NAR，NIR和HyR的活性（圖3）。其中，CBF組通常擁有最高的酶活性，而在CF組中是最低的酶活。CBF和COM組中NAR和NIR的活性更高，但是HyR活性沒有明顯區別。結果顯示有機肥，特別是添加生物肥料之后，可以增強反硝化酶的活性。
圖3 不同施肥模式下反硝化酶活性統計分析
3.4反硝化基因豐度
和未施肥組相比，三種施肥處理明顯增加了nirK基因的數量。CF組nirK拷貝數最高，比CBF組和COM組分別高36.5%和20.9%（圖4）。但是，CF組中nirS和nosZ的基因拷貝數并沒有發生顯著變化。結果顯示施肥處理對三種類型的反硝化基因的豐度有不同影響。另外發現，NIR是和nirS而不是nirK亞硝酸還原酶基因的豐度有密切關聯。
圖4 nirK-、nirS-和nosZ型反硝化菌群的豐度及NIR活性和nirS或者nirK拷貝數之間的關系
3.5 與土壤理化性質的關系
冗余分析用來檢測之土壤理化性質，反硝化細菌群落豐度和反硝化酶活性之間的相互關系（圖5）。順著軸1看CF及CK處理組，發現很大程度上和COM及CBF處理組分的很開。可以看出，反硝化菌群的豐度和SOC，NH4+，NO3-和WHC呈現正相關，和MBC/MBN，pH呈現負相關。NirS的豐度明顯和nirK和nosZ型硝酸鹽還原酶基因拷貝數成正相關。反硝化酶活性和NH4+，SOC，NO3-呈正相關，和pH，MBC/MBN是負相關。總之，結果表示NH4+，SOC，NO3-和土壤pH顯著影響反硝化酶活。還有，自動線性建模表明nirS型反硝化菌群，土壤SOC，NO3-和pH是和土壤N2O的排放相關的主要影響因子（圖6）。
圖5 反硝化菌群豐度與反硝化酶活和土壤生態因子之間的冗余分析
圖6 自動線性建模預測分析反硝化基因豐度的重要性和挑選影響N2O排放的土壤理化屬性
3.6 反硝化細菌群落的豐度和多樣性
四組樣本測序共獲得195,904條nirK序列，183,441條nirS序列和375,839條nirK序列。CBF組中序列數量最多，隨后是COF，CF和CK。施肥增加了反硝化細菌相關的OTUs的豐度（用chao1和Ace評估）。CBF中nirS和nosZ的豐度要高于其他施肥處理組，也顯著高于對照組。但是施肥并沒有顯著影響nirK的Simpson和Shannon指數。COM和CBF組中nirS和nosZ的α多樣性要高于CK和CF組。結果表明有機肥料結合化學肥料顯著增加了nirS和nosZ的多樣性，而不包括nirK的多樣性。
3.7 反硝化細菌群落結構（熱圖）
施肥方式顯著影響了反硝化細菌群落的基因型變化（圖7）。NirK型反硝化菌群組成在COM和CBF中是相似的，但是和CK和CF相比是有顯著差異的。同時nirS型反硝化菌群組成在COM和CBF中也是高度相似的，有著相同的優勢OTUs。而且NosZ基因中也有相同趨勢，CK和CF組總nirS和nosZ型群落幾乎是重疊的。總之，有機肥料導致nirK，nirS和nosZ型反硝化細菌群落結構發生巨大變化。
圖7 相對豐度top30微生物屬聚類熱圖分析
4、總結
有機改良劑（例如牛糞和生物肥料）的施用，減少了累積N2O的排放，降低了排放系數，同時增加了反硝化酶活性。研究結果表明，土壤中N2O的排放主要是和nirS型反硝化細菌的豐度、土壤有機碳（SOC）和NO3-相關，而反硝化細菌群落的變化和SOC、NO3-、NH4+、持水力和土壤pH密切相關。總之，有機肥料增強了反消化酶活性，增加了反硝化細菌基因的拷貝數，但是減少了N2O的排放，同時發現nirS和nosZ型反硝化細菌群比nirK型反硝化細菌群對有機肥料更敏感。
本研究亮點：
1、NirS和nosZ菌群不受化學肥料而受有機肥料的影響；
2、SOC、NO3-、NH4+和pH是促進反硝化細菌群落豐度發生變化的主要影響因子；
3、影響N2O排放的重要因素是nirS菌群、SOC和硝酸鹽；
4、生物肥料和有機肥料同時使用可以顯著降低N2O的排放。
參考文獻
Tao R, Wakelin S A, Liang Y, et al. Nitrous oxide emission and denitrifier communities in drip-irrigated calcareous soil as affected by chemical and organic fertilizers [J]. Science of the Total Environment, 2018, 612:739.
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