2025-09-04
研究物種：小鼠
發表期刊：Phytomedicine
發表時間：2025年
影響因子：8.3
文章亮點
系統性的機制預測：采用網絡藥理學“多成分-多靶點-多通路”的研究思路
多成分篩選： 不是簡單地研究單一成分，而是從川科止注射液的復雜中藥復方中，篩選出多個潛在的活性化合物成分（如黃芩苷、熊果酸等）。
多靶點預測： 通過數據庫分析和網絡構建，預測出這些活性成分可能作用的多個關鍵靶點（如IL-6、TNF-α、VEGFA、MAPK1、AKT1等），清晰地展示了中藥“多靶點”協同作用的特點。
多通路整合： 研究并未將機制局限于某一條通路，而是通過富集分析發現，這些靶點顯著富集在多條與炎癥和免疫密切相關的通路上，如TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等，揭示了其作用的全局性和系統性。
嚴謹的實驗驗證：從體內到體外的多層次證據鏈
體內動物實驗： 在哮喘小鼠模型中，通過川科止注射液進行治療，證實了其確實能夠有效緩解氣道炎癥（如降低炎癥細胞浸潤）、減輕氣道高反應性（AHR）等關鍵哮喘癥狀。這驗證了藥物的整體療效。
體外細胞實驗： 在細胞層面（如人支氣管上皮細胞16HBE），使用LPS誘導炎癥模型，進一步驗證了川科止注射液的抗炎作用。研究表明它能顯著抑制關鍵炎癥因子（如IL-6, TNF-α, IL-1β）的釋放。
分子機制驗證： 實驗的最終層深入到蛋白和基因水平。通過Western Blot、qPCR等技術，證實了川科止注射液能夠抑制網絡藥理學所預測的PI3K/AKT和MAPK信號通路的激活，即下調p-PI3K、p-AKT、p-p38等關鍵磷酸化蛋白的表達。這使得最初的預測得到了堅實的實驗數據支撐，形成了完整的閉環。
研究模式的示范性：為中藥現代化研究提供了經典范例
本研究完美展示了如何利用計算生物學（網絡藥理學）作為“導航”，快速、高效地提出復雜中藥體系的作用機制假說。
然后通過傳統的生物實驗手段（體內外實驗）進行“驗證”，將虛擬預測轉化為客觀證據。
這種 “預測 + 驗證” 的研究模式，極大地提高了中藥機制研究的效率和針對性，避免了盲目篩選，是中醫藥走向現代化、國際化和被現代醫學認可的重要途徑。
研究背景
哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，現有治療方法仍存在局限性。川科止注射液（CKZI）是一種中藥復方制劑，臨床上顯示出良好的抗哮喘療效，但其作用機制尚不明確，缺乏系統的科學闡釋。因此，本研究旨在運用網絡藥理學和實驗驗證相結合的方法，深入揭示CKZI治療哮喘的抗炎作用機制。
研究思路
研究方法
空間代謝組、網絡藥理學
研究結果
1.CKZ的化學成分
CKZ由兩種中國草藥組成：yinyanghuo和bajiitian（表1）。通過LC/MS分析鑒定了134種CKZ化合物。類黃酮化合物通常被認為是其抗炎和抗氧化作用的關鍵成分。根據現有結果，我們從選擇中確定了12種關鍵化合物。
圖1Chuankezhi注射液的總離子色譜圖（TIC）
2. MALDI-TOF的空間代謝組分析
如圖2所示，MALDI-TOF的結果呈現了CKZ干預后小鼠肺組織中關鍵類黃酮化合物的原位空間分布。在這項研究中，MALDI-TOF在肺組織中成功檢測到了各種類黃酮，包括Icariin，Epimedin A，B和C等，這可能在氧化應激和炎癥調節中起重要作用。光譜中的主要峰分布在中等質量范圍內，這表明樣品中的類黃酮化合物具有相對濃縮的分布。
圖2.MALDI-TOF的空間代謝組分析
3.網絡藥理學分析
通過swiss目標預測篩選了1084個CKZ靶標，總共確定了638個重疊目標（圖3A）。如圖3B的網絡分析所示，將主要的藥物靶標和疾病進口到Cytoscape 3.9.0進行可視化，從而導致“組件 - 靶向疾病”網絡圖的構建，這表明它包含766個節點和4187個邊緣。值得注意的是，單個活性成分可能對應于多個靶標，并且不同的活性成分也可以共享相同的靶標，表明該藥物通過多型，多毒劑機制對疾病產生影響。如圖3C所示，將638個相交目標導入到字符串數據庫中進行分析，從而產生PPI網絡圖。該網絡包含638個節點和14,614個邊緣。按程度排名的前五個節點是TNF，AKT1，IL6，GAPDH和SRC，表明這些節點在PPI網絡中占據中心位置，并且具有密集的連接。表4顯示了前10個靶標。這些選定的基因靶標可能是藥物治療哮喘的核心靶標，藥物療效的機理可能與這些基因的表達有關（圖3D-E）。使用David數據庫，對靶基因的富集分析顯示了GO富集術語，其中包括與生物學過程（BP）相關的1425個，165個與細胞成分（CC）相關的術語（CC）和352個分子功能（MF），P <0.05。 BP項主要涉及細胞凋亡的陰性調節，細胞增殖的陽性調節，蛋白質磷酸化的陽性調節以及內皮細胞增殖的陽性調節。 MF項主要包括酶結合，受體結合和蛋白酶結合，而CC項主要涉及線粒體，蛋白質復合物和細胞內膜結合的細胞器。表5顯示了前十BP，CC和MF項，圖3F。結果暗示，治療哮喘的CKZ可能與以下BP高度相關：肽基 - 酪氨酸磷酸化，磷脂酶C激活G蛋白偶聯受體信號途徑，胞質鈣離子濃度的陽性調節，蛋白質自動磷酸化和蛋白質磷酸化。 CC術語側重于凋亡過程，受體復合物，膜筏，樹突和質膜外側的負調節。具有最高富集的MF術語主要涵蓋跨越蛋白酪氨酸激酶活性的非膜性的。
p值<0.05的20個術語來自KEGG途徑分析（表6）。圖3G通過條形圖和氣泡圖顯示了富集值的前20個途徑。結果表明，CKZ治療哮喘的機制主要涉及癌癥中的途徑，神經活性配體 - 受體相互作用，MAPK信號通路，PI3K-AKT信號通路和鈣信號通路。根據富集評分排名，MAPK途徑可能是最重要的調節途徑之一，而線粒體可能是最關鍵的細胞器。基于上面的信息，我們將通過隨后的實驗進一步驗證這些信息。
圖3 CKZ治療哮喘的網絡藥理學預測。
4.分子對接分析
以前，我們在表3中篩選了12個鍵的類黃酮化合物。Epimedin B，瓜素，epimedin A，Baohuoside I的峰等級相對較高，這表明這四種可能是發揮觀察到的效果的主要活性成分。結合MALDI-TOF，EPIMEDIN B，PUERARARIN，EPIMEDIN A和BAOHUOSIDE I的分析，富含在肺組織中。 TNF被確定為具有最高程度的目標，表明它可能是CKZ發揮其功能的最關鍵因素。基于此，進行了分子對接分析。這四種化合物的結合能范圍從-5到-10，表明相對較好的結合性能。其中，epimedin a和b與TNF的結合能分別小于-7（-7.5和-7.4），表明具有高結合強度和潛在的更高的生物學活性。 （圖4A和表7）。表面等離子體共振（SPR）分析表明，固定在CM5傳感器芯片上的TNF-α可以與具有不同親和力的所有四種測試化合物結合。這些結果表明，在四種測試化合物中，Epimedin A具有與TNF-α的結合親和力最高。
圖4分子對接結果
5. CKZ改善了HDM誘導的氣道炎癥和HDM誘導的哮喘小鼠模型的重塑
我們使用HDM來建立哮喘小鼠模型。（圖5A）支氣管壁增厚，炎癥細胞浸潤和杯狀細胞的增生是用于評估哮喘病理嚴重程度并代表哮喘的主要特征的關鍵標記。在肺組織中，H＆E染色顯示周圍和周圍的周圍和周圍的周圍炎癥細胞浸潤增加，氣道上皮細胞脫離以及HDM誘導的哮喘的小鼠的粘液產生過多。模型組中可比的炎癥得分明顯高于對照組中的炎癥分數（p <0.001）。 CKZ在低，中和高劑量以及DEX（1 mg/kg）組中表現出顯著的抗炎作用。 CKZ治療顯著降低了炎癥細胞浸潤，上皮損傷和粘液過量產生，從而導致炎癥評分大大降低（P <0.001），表明與模型組相比恢復（圖5B和C）。與對照組相比，在哮喘模型的氣道上皮中，膠原蛋白纖維含量顯著增加，如Masson的三色染色所示（圖5B和C）。此外，通過CKZ和DEX的給藥可以明顯改善膠原蛋白纖維含量。 DEX管理似乎比CKZ更有效。PAS染色顯示模型組氣道上皮中的杯狀細胞（GC）增生，而對照小鼠中未觀察到這種變化。與對照組相比，模型組的標準化GC面積（圖6B和C）顯著增加（P <0.001）。然而，在CKZ和DEX組中，這種增加顯著降低（p <0.01）。這些發現表明，Ckzand Dex有效抑制了哮喘小鼠肺中的GC增生。這些結果表明，HDM誘導的哮喘導致肺組織的組織病理學變化。CKZ對減輕哮喘的組織病理學特征有明顯的影響。
圖5CKZ可以減輕哮喘小鼠氣道炎癥和線粒體損傷的損害。
6.CKZ處理調節哮喘的血清和BAL中的炎癥細胞和介質
如圖6A和B所示，HDM誘導的小鼠BALF的總細胞和嗜酸性粒細胞的明顯升高相對于對照組。相反，CKZ和DEX給藥減少了總細胞和嗜酸性粒細胞計數。此外，在血清分析中，我們觀察到與鹽水組相比，我們觀察到2型炎癥因子（IL-4，IL-5，IL-13和TNF-α）的明顯增加，這是肺部炎癥的關鍵指標。 CKZ治療表現出降低炎癥因子水平的趨勢，表明其潛在的抗炎特性（圖6C）。此外，HDM挑戰還導致BALF內IL-4，IL-5，IL-13和TNF-α的顯著增加。顯然，與HDM組相比，CKZ和DEX處理都大大降低了BALF炎癥性細胞因子的表達（圖6D）。根據先前的結果，MAPK信號傳導是CKZ介導的最重要的途徑之一。在由HDM誘導的哮喘小鼠的肺組織中，相對于對照組中的JNK，ERK和P38的磷酸化水平增加，CKZ和DEX的處理有效地降低了磷酸化的JNK，ERK和P38的水平，導致MAPK Signalk Signalk Signalking Pathway的抑制（圖6E）。
圖6CKZ可以降低哮喘小鼠的BALF和血清中炎性細胞的表達和因子。
7. p38/MAPK途徑在哮喘中的作用和CKZ的調節作用
基于上述結果，我們進一步探討了使用p38 MAPK抑制劑（p38-i，SB 203,580）以及CKZ對p38途徑的抑制作用（圖7A）。 HE，Masson和PAS染色的結果初步表明，使用p38抑制劑可以顯著改善哮喘誘導的肺損傷（圖7B-C）。對TEM結果的進一步分析還表明，阻斷p38途徑可以減輕肺組織中的線粒體損傷（圖7D）。進一步的蛋白質印跡結果表明，CKZ-H（高劑量）可以抑制p38途徑的關鍵蛋白（P-MKK3/6，P-P38）的磷酸化，這可能是CKZ發揮其抗炎作用的關鍵途徑之一（圖7E）。
圖7 p38/MAPK途徑在哮喘和CKZ的調節作用中的作用。
8.CKZ可以調節BEAS-2B細胞中的炎癥反應
為了評估CKZ在24小時48小時內誘導的細胞毒性，測量了細胞活力。在CCK-8測定中，在24小時和48小時治療后，CKZ濃度分別為16％，細胞活力分別為57.58％和55.43％，并且未降至50％以下。根據結果，確定細胞活力超過80％的濃度范圍為2％至8％。因此，建議將8％作為后續實驗的安全劑量。 （圖8a）EDU測定進行EDU測定以評估細胞增殖。使用熒光顯微鏡定量EDU陽性細胞的百分比。在HDM組中，與對照組相比，觀察到EDU陽性細胞的數量顯著增加，表明細胞增殖增強。相比之下，CKZ（2％，4％，6％）和DEX組的增殖速率低于HDM組和對照組，而6％CKZ組和DEX組對細胞增殖表現出最強的抑制作用。 （圖8b和c）另外，通過傷口愈合測定法評估了細胞遷移，我們在0 h，12 h和24 h時測量了刮擦寬度，以比較差異。暴露于HDM（模型組）的BEAS-2B細胞在12 h和24 h時表現出比對照細胞差異更嚴重的（p <0.001，圖8D和E）。與HDM處理的細胞相比，CKZ治療（2％CKZ，4％CKZ，6％CKZ）和DEX治療都顯著改善了愈合區域的細胞遷移，而HDM處理的細胞在12 h和24 h（p <0.01，p <0.01，p <0.01，p <0.001和p <0.001和p <0.001均分別為p <0.001和p <0.001，圖8D和e）。
CKZ使BEAS-2B細胞中的MAPK途徑失活，以研究CKZ抑制HDM誘導的細胞損傷的機制，使用Western blotting在BEAS-2B細胞中分析了與MAPK相關蛋白的表達。結果表明，CKZ抑制了MAPK途徑中HDM誘導的ERK，JNK和P38的磷酸化（分別為P <0.001，圖8F）。
圖8 CKZ可以調節BEAS-2B細胞中的炎癥反應。
9. CKZ減輕了HDM誘導的BEAS-2B細胞中線粒體損傷
哮喘患者的氣道上皮細胞在接觸過敏原、空氣污染物、炎癥介質時可能會出現線粒體功能障礙。這可能導致線粒體膜電位降低，活性氧（ROS）產生增加，細胞能量代謝紊亂。BEAS-2B細胞用Mito Tracker Red染色。使用共聚焦顯微鏡捕獲線粒體圖像，隨后用ImageJ軟件進行分析和骨架化。結果清楚地表明，HDM治療導致線粒體分支長度減少，導致線粒體斷裂；6%的CKZ、P38-I（SB 203580）和DEX治療都有助于恢復線粒體網絡（圖9A）。DCFH-DA的流式細胞術分析顯示，HDM提高了細胞ROS的產生（圖9B）。相比之下，CKZ、P38-I（SB 203580）或DEX治療顯著減少了HDM誘導的ROS積累。JC-1染色的流式細胞術分析表明，HDM治療加重了MMP的損失，而CKZ、P38-I和DEX對HDM治療的BEAS-2B細胞中的線粒體具有保護作用（圖9C）。這些發現表明，CKZ不僅保護線粒體，而且具有抗凋亡作用。
CKZ對BEAS-2B細胞p38/MAPK通路的調控作用為了研究CKZ對p38/MAPK信號通路的調節作用，我們進行了蛋白質印跡分析，以評估BEAS-2B電池中p38通路的激活狀態。CKZ處理顯著抑制了MKK3/6和p38的磷酸化，而MKK3/6和p38總蛋白水平保持不變。（p<0.001，圖9D）這表明CKZ主要通過去磷酸化調節p38活性。此外，當細胞用p38抑制劑處理時，觀察到MKK3/6和p38磷酸化的類似減少。這些發現表明，CKZ可能通過下調p38/MAPK通路的激活來發揮其調節作用。
圖9 CKZ減輕了HDM誘導的BEAS-2B細胞中線粒體損傷。
結 論
總之，本研究的數據表明，CKZ可以抑制小鼠HDM哮喘模型中的氣道炎癥，減輕肺支氣管上皮細胞的線粒體損傷，并抑制MAPK信號通路的激活，這可能有助于闡明CKZ在哮喘治療中的潛在調控機制。
參考文獻
Yuan J, Wang Y, Sha B, Zhang Y, Mokuy OOEM, Jin M, Yu L, Xu X. Network pharmacology and experimental validation of inflammation inhibition by ChuanKeZhi Injection in treating asthma. Phytomedicine. 2025 Jul 25;143:156891. doi: 10.1016/j.phymed.2025.156891. Epub 2025 May 21. PMID: 40450983
