2025-08-24
在空間轉錄組技術中，樣本處理的每一個細節都直接影響實驗結果的可靠性。從組織采集到測序前的質控，任何環節的疏漏都可能導致數據偏差甚至實驗失敗。本文將圍繞樣本處理全流程、質控標準、避坑指南等展開，為您呈現空間轉錄組樣本處理的標準。
一、空間轉錄組測序樣本準備與處理
1、空間轉錄組實驗設計與樣本重復數
（1）空間轉錄組實驗設計和樣本選擇
①腫瘤疾病方向：
腫瘤vs正常（癌旁）、腫瘤不同進展時期、腫瘤不同區域、泛癌的組織樣本，揭示腫瘤發生發展過程中，樣本的空間異質性；
同治療方法和不同預后程度設置組別取樣，比較不同治療方法（如手術、放療、化療）對腫瘤微環境的影響，探討治療效果的分子機制，及分析不同預后程度 （如生存期長短） 的腫瘤患者的空間轉錄組特征，尋找潛在的預后標志物。
②神經發育方向：
胚胎、腦、腸、肺等按照發育時期取樣，發育時期推薦至少3個取樣點，若通過其他研究已聚焦某個關鍵發育時期，可選取特定發育階段的組織樣本，揭示其背后的空間分子機制。
（2）空間轉錄組樣本重復設置建議
①區分生物重復與技術重復：
生物重復：指不同來源的獨立個體（例如，不同的小鼠、不同的病人樣本、來自同一個體的不同器官/組織塊）。空間轉錄組實驗的核心是必須有足夠的生物重復。
技術重復： 指同一份生物樣本在實驗流程（如切片、文庫構建、測序）中的重復處理。例如，對同一組織塊的相鄰切片分別進行空間轉錄組檢測。
②設置生物重復數量的建議：
每組至少3個，強烈推薦4-6個或更多獨立的生物重復，是獲得可靠、可重復且有統計學意義結論的基礎。
2、空間轉錄組樣本處理全流程
（1）樣本準備
①OCT包埋
新鮮組織樣本，建議在30min內包埋，取下后迅速用預冷的PBS溶液或者生理鹽水沖洗組織表面殘留，然后用干凈的吸水紙吸干液體。此步驟一定要吸干水分，如有液體殘留，OCT包埋后，組織表面形成冰晶，影響切片效果，整個樣本處理過程需要保持低溫環境。
注：包埋好后最好立即送樣切片，暫時儲存可在-80℃存儲3個月內，可以干冰過夜運輸寄送即可；
②石蠟包埋
盡可能取活性較好的組織樣本并隨即投入固定液。材料應該小而薄，一般厚度大于3mm，大小不超過6.5×6.5mm2；
注：蠟塊存放于室溫或 4~8℃，石蠟包埋樣本需要冷凍冰袋送樣（2-3個即可），無需干冰，順豐寄送；蠟塊制作流程，要求脫水充分、浸蠟充分，切片可連續切片成片、無裂痕和空腔（組織本身自帶除外），樣本切片過程中不會與外部包埋的蠟分離。
（2）選片
無論是新鮮冷凍組織樣本還是FFPE樣本，都需要通過普通HE染色，選擇組織形態的完整性較好的切片進行后續實驗。
（圖片來自10x）
（3）正式實驗
①組織透化
10×Visium組織預透化（Tissue Optimization，也叫組織優化）：連續切片子，在預透化玻片上進行組織預透化實驗，其目的是摸索最佳的mRNA釋放時間（透化時間），以便達到最好的實驗效果。具體過程如下：
選擇目標區域附近的組織切片，在普通玻片上進行固定和染色；采用不同的時間梯度，進行透化處理，6個透化梯度時間樣本（官方推薦3/6/12/18/24/30 min），1個陰性對照，1個陽性對照；用帶有熒光的核苷酸進行反轉錄合成cDNA。酶處理移除樣本組織，然后對帶有熒光標記的cDNA進行成像；對比H&E和熒光成像，選擇熒光信號較強、mRNA彌散較小、內部組織結構清晰的時間點，作為正式實驗透化時間點。
華大Stereo-seq預透化：
對新鮮或冷凍組織進行 OCT 包埋，連續切取厚度為 10μm 的切片。建議制備至少 4張用于透化測試的切片，并額外保留2張用于H&E染色及質檢。具體實驗過程根據華大 STOmics Stereo-seq 透化試劑套裝進行預透化實驗，最終選擇在組織移除干凈且保持相同成像條件（包括亮度和曝光等條件）的情況下，以組織形態完整、熒光值較強且無彌散為最佳透化時間的判斷標準。
②cDNA文庫構建
使用組織表達芯片進行空間轉錄組文庫制備。按照最佳組織透化時間進行組織透化，釋放組織mRNA與芯片上的捕獲序列結合，逆轉錄合成cDNA片段并標記空間位置，PCR擴增合成cDNA二鏈。通過堿性環境使cDNA變性將cDNA二鏈釋放到液體游離環境，以cDNA二鏈為模板進一步擴增合成大量cDNA。將cDNA酶切打斷成200-300bp的片段，加上P5接頭、i5樣本索引、read 2、i7樣本索引和P7接頭構建標準測序文庫。
（4）上機測序
使用Illumina 或華大T7測序平臺進行上機測序。
（5）數據分析
利用10×Space ranger 數據或Stereo-seq Analysis Workflow軟件對測序獲得的原始數據進行初步分析，組織染色照片和芯片序列號一同輸入軟件進行數據質控和序列比對，從而獲取高質量的測序數據、Spot/Bin在組織中的空間分布位置以及基因在各個Spot/Bin 的表達量情況。隨后利用這些數據開展分群、亞群特征基因分析、Spot/Bin 注釋、空間擬時分析、空間通訊分析等深入研究。
二、空間轉錄組測序樣本質檢
空間轉錄組測序樣本質檢中，RNA 完整性是核心指標，直接影響基因表達數據的可靠性及檢測基因的完整性。其評估常通過 RNA 完整性數值（RIN）衡量，數值越高，代表與空間轉錄組探針結合的幾率就越高。其次新鮮冷凍OCT包埋（FF）（RIN≥7） vs石蠟包埋 FFPE（DV200≥30%）組織的質控閾值不同。
1、新鮮冷凍OCT包埋組織
新鮮冷凍組織的 RNA 質量主要以 RIN 值衡量，該值通過 Agilent 2100 生物分析儀基于電泳圖對真核總 RNA 質量分類，范圍 1-10，1 代表降解嚴重、10 代表完整性高。
注：通常切取 10 片組織切片進行 RNA 抽提和質檢，建議使用 RIN 值＞7 的樣本開展空間實驗。
（不同樣本的rin值檢測圖片，來自安捷倫官方）
2、FFPE組織樣本
石蠟包埋（FFPE）組織是生物學尤其是醫學領域常見的組織保存形式，但該方式會導致DNA/RNA 降解，mRNA的polyA尾斷裂，故采用DV200 進行檢測，DV200指超過 200 個核苷酸RNA片段百分比，其值越高，RNA完整度及與空間探針的結合概率越高。
一般切取5-10片FFPE組織切片進行RNA抽提并進行DV200檢測，建議使用DV200≥30%的FFPE樣本進行Visium實驗。
三、避坑指南
空間轉錄組各種不好處理的樣品組織如骨組織（硬骨、軟骨）、脂肪、血管、肌肉、皮膚專用處理方案。
1、骨組織
硬骨組織堅硬、需脫鈣、透化難。軟骨組織高基質密度阻礙透化/RNA釋放，因此硬骨和軟骨務必進行溫和脫鈣（推薦EDTA，避免強酸），嚴格監控時間防止過脫鈣。顯著延長透化時間或使用增強型透化試劑，確保RNA有效釋放。處理全程保持低溫，保護RNA。
2、脂肪組織
脂肪組織結構特殊，含有較多的油脂成分，無論是冰凍切片還是石蠟包埋切片都較其他組織困難。小鼠/人優先FFPE或FF，其他選 FF；FFPE制備需用固定液，紗布蓋防漂浮，嚴控無水乙醇、二甲苯脫水時間；對于FF樣本，相比于其他組織，脂肪組織通常需要更厚的切片，推薦10-20μm。
3、血管組織
血管組織由內皮細胞、平滑肌、結締組織及彈性纖維構成，管壁分層明顯（內膜、中膜、外膜），質地較脆且易收縮，血管腔易塌陷，無論是冰凍切片還是石蠟包埋切片都較其他組織困難。小鼠 / 人血管組織優先 FFPE ，因為其采用的OCT包埋劑灌注難度較大。血管 FFPE 樣本因管壁含較多彈性纖維，易出現切片碎裂，建議采用防脫載玻片，因血管組織切片在水浴中易發生腔室變形，故可降低展片溫度并縮短展片時間。
4、肌肉組織
肌肉組織由肌纖維與結締組織構成，肌纖維排列有序且韌性較強，肌纖維與結締組織結合緊密程度不一，切片時易出現肌纖維斷裂、切片褶皺、層次分離等問題。小鼠/人肌肉組織優先采用FF或FFPE組織形式，優先選擇FF，OCT作為冷凍包埋劑，能在低溫下快速固定肌纖維排列，減少冰晶對肌纖維的損傷，且無需高溫處理，可最大程度保留 RNA 的分子活性，更適配空間轉錄組對基因表達原位信息的精準捕捉。
5、皮膚組織
皮膚由表皮和真皮構成，與皮下組織相連，由于皮膚層次豐富，結構復雜，質地堅韌，各層細胞間的致密度不同，在切片中常出現皺網狀層松散、淺層出現碎裂等。建議人和小鼠物種采用FFPE組織形式。取材時切下皮膚愈早固定愈好，防止時間過長引起組織收縮變形或發生自溶。包埋組織包埋時表皮朝上，皮下組織朝下，切片時依次從皮下組織、真皮層、表皮層，最后切角質層。皮膚FFPE樣本高脂質含量，粘性較低導致脫片，建議采用防脫載玻片，因皮膚組織切片在水浴中能迅速膨脹，故可降低展片溫度。
四、總 結
空間轉錄組實驗成敗，樣本處理是核心。從科學設計（合理選樣、充足生物重復）、全流程規范操作（包埋、透化等），到嚴格質控（FF的RIN≥7、FFPE的 DV200≥30%），再到特殊組織專屬方案，每步精細把控，方能保障數據可靠，助力科研工作者更精準地解碼生命的空間奧秘。
