研究物種：小鼠
發表期刊：Carbohydrate Polymers
發表時間：2023年
影響因子：12.5
文章亮點
創新性地發現并證實了Usp10是羊肚菌多糖（MEP）保肝作用的關鍵上游靶點。
系統闡明了MEP通過激活Usp10，一方面抑制NF-κB炎癥通路，另一方面激活Nrf2抗氧化通路，從而協同發揮強大保肝作用的分子機制。
利用嚴謹的基因敲低/敲除實驗驗證了Usp10在此機制中的核心樞紐作用。
為天然產物保肝機制研究開辟了新視角，并提升了羊肚菌作為保肝功能性資源的應用價值。
研究背景
酒精性肝病（ALD）是由長期過量飲酒引起的，其特征是脂肪在肝臟中積聚，并逐漸發展為脂肪變性，伴有炎癥、肝纖維化和肝硬化。全球超過7500萬人患有酒精使用障礙，患酒精相關肝病的風險很高。酒精及其代謝產物促進腸道微生態失調，增加腸道通透性，并誘導細菌產物從腸道轉移到肝臟，從而誘導促炎因子的產生，從而促進ALD的發展。
羊肚菌（Morchella esculenta，ME）是一種高營養價值的獨特藥用和食用同源真菌，主要生長在中國、韓國、日本和歐洲闊葉或混交針葉林的腐殖質層中。ME主要用于治療消化不良、痰相關疾病和呼吸急促。在酒精誘導的急性肝損傷小鼠模型中，ME通過調節NF-kB/Nrf2信號通路具有肝臟保護作用。然而，MEP在慢性酒精性肝損傷中的詳細結構和療效分析及其潛在機制尚未系統報道。本研究基于對腸道微生物組、代謝組和蛋白質組分析，為MEP2在慢性酒精誘導的肝損傷中的應用提供了實驗證據。
研究思路
研究方法
微生物組、轉錄組、蛋白質組
研究結果
MEP2的純化與結構表征
使用DEAE-52色譜柱純化MEP（圖1A），并分析了MEP-A、MEP-B和MEP-C對酒精誘導的細胞損傷的保護作用。MEP-A和MEP-B均在HepG2細胞中表現出較強的保護作用（圖1B）。MEP2由單糖Glc（90.971%）、Gal（0.161%）、Man（0.145%）和Glc-UA（0.094%）組成（圖1G）。分子量（Mw）為510至980 kDa的多糖是MEP2的主要成分（約63.4%，圖1H）。MEP2的平均Mw為959 kDa（圖1I）。
采用核磁共振波譜進一步分析了MEP2的結構特征。利用掃描電鏡觀察MEP2的微觀結構和形貌特征。大多數MEP2殘基具有紙狀結構，只有少數殘基呈棒狀或線圈狀，表明MEP2具有無定形結構（圖2）。
圖1. MEP2的純化和初級結構表征
圖2. 利用核磁共振和掃描電鏡對MEP2進行結構表征
MEP2改善了慢性酒精性肝損傷小鼠的病理和生化改變
長期飲酒抑制小鼠體重增加，與CTRL小鼠相比，心臟、肝臟、肺和腎臟指標升高，脾臟指數和胸腺降低。長期酒精攝入導致小鼠肝細胞索紊亂、肝細胞腫脹、脂肪液泡數量增加、炎癥細胞浸潤和肝細胞核數量減少，這些都被MEP2和Sil強烈逆轉（圖3A）。試驗組均未發現心、肺、脾、腎、腦、胸腺有明顯變化；與載體處理的酒精給藥小鼠相比，在慢性酒精誘導的小鼠中，MEP2強烈抑制天冬氨酸氨基轉移酶，丙氨酸氨基轉移酶，γ-谷氨酰轉移酶和CYP2E1并增加肝臟ADH水平和醛脫氫酶（圖3B-F）。
圖3. MEP2在慢性酒精誘導小鼠中顯示出肝臟保護作用
MEP2 改變了慢性酒精誘導小鼠的腸道微生物
在CTRL、載體處理酒精給藥組和MEP2處理酒精給藥組中，總共分別發現了6304個（25.99%）、6297個（25.96%）和7409個（30.55%）獨有OTUs，在所有組中發現了1514個（6.24%）共有OTUs（圖4A）。MEP2給藥促進擬桿菌的增殖至52.63%，并將厚壁菌的相對豐度降低至40.76%（圖4B）。此外，還分析了三組中豐度變化最大的前20個細菌屬（圖4C-G）。
使用MetaCyc數據庫對酒精給藥組和MEP2處理的酒精給藥組之間與改變的腸道細菌相關的代謝途徑進行分析。在8條一級功能通路中，分析了58條二級功能通路，脂肪酸和脂質生物合成、TCA循環、醇降解、脂肪酸和脂質降解和醛降解與肝臟酒精代謝有關（圖4H）。
圖4. MEP2調節慢性酒精誘導小鼠腸道菌群
MEP2改變了慢性酒精誘導的肝損傷小鼠血清中的代謝物水平
實驗組共檢出血清代謝產物1035種，包括脂質和類脂分子，有機酸及其衍生物。KEGG富集分析顯示MEP2改變了22條代謝途徑，分別與氨基酸代謝、碳水化合物代謝、消化系統、癌癥代謝、信號轉導等有關（圖 5A）。與載體處理的酒精給藥組相比，MEP2增加了一種代謝物的水平，降低了13種代謝物的水平（圖5B）。血栓素B2（TXB2）水平與白三烯B4（LTB4）水平之間存在顯著的正相關關系（圖5C）。相關性分析表明TXB2水平與食鹽桿菌豐度呈強正相關，與脫鹽桿菌和瘤胃球菌豐度呈強負相關，LTB4水平與乳酸桿菌和脫鹵桿菌豐度呈強負相關（圖5D）。
圖5. MEP2調節慢性酒精誘導小鼠血清代謝物水平
蛋白質組學分析
GO富集分析顯示與線粒體功能相關的細胞成分以及與氧化還原酶活性相關的分子功能（圖6A）。載體處理的酒精給藥組中觀察到21種蛋白質（如Pafah1b2，Usp10和Cldn3）的下調，MEP2強烈逆轉（圖6B）。MEP2抑制PAF受體，并增強了Usp10，Cldn3、1b2、Mtx2、Mrps2、Cox7c、Taco1（圖6C）。IHC結果進一步證實，由MEP2誘導的慢性酒精損傷小鼠的UsP10的肝臟水平升高（圖6D）和PAFR的下降（圖6E）。
圖6慢性酒精誘導小鼠肝臟的蛋白質組學分析
MEP2減輕了慢性酒精誘導的肝損傷小鼠中與NF-κB相關的炎癥
酒精性肝病的特征是肝臟中巨噬細胞和中性粒細胞的募集和活化，釋放有害介質，從而增加炎癥。長期飲酒會提高腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達水平，降低IL-6，NF-kB、IKK、IkBα、IL-10水平，但這些變化均被MEP2顯著逆轉（圖7A）。與載體處理酒精給藥組相比，MEP2導致在小鼠的肝臟中干擾素（IFN）-α，IFN-γ，TNF-α，IL-6和IL-17水平降低。IHC結果進一步證實了MEP2對慢性酒精誘導小鼠肝臟磷酸化NF-kB水平的抑制作用（圖7）。
圖7 MEP2抑制了小鼠酒精誘導的炎癥反應
MEP2 通過 Nrf2 改善氧化應激
與載體處理的酒精給藥小鼠相比，在慢性酒精誘導MEP2給藥小鼠的肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）水平均顯著提高（圖8C-E），ROS和MDA水平顯著降低（圖8A-B）。WB結果顯示，Nrf2及其下游蛋白的表達水平，包括CAT、NQO、HO-1、SOD-1在慢性酒精誘導小鼠的肝臟中的表達水平降低，MEP2治療顯著改善（圖8F）。IHC結果進一步證實了Nrf2表達的增強（圖8G）。MEP2有效地改善了氧化磷酸化，并抑制了長期飲酒引起的氧化應激損傷。
圖8 MEP2改善慢性酒精誘導小鼠肝臟中的氧化應激
結 論
從羊肚菌中提取并純化了水溶性羊肚菌多糖2（MEP2），分子量為959kDa的MEP2具有a→4)-α-D-Glcp-(1→葡聚糖主鏈，并且該分支在H-6位置被α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→殘基和α-D-Glcp-(1→殘基。在慢性酒精誘導的肝損傷小鼠中，MEP2通過Usp10/Nrf2/NF-kB信號通路調節血清代謝產物和腸道微生物群的水平，以抑制炎癥反應和氧化應激，減輕肝損傷。這些數據支持了MEP2作為酒精性肝損傷潛在治療策略的應用。
參考文獻
Shanshan Teng, Yongfeng Zhang, Xinghui Jin, Yanfeng Zhu , Lanzhou Li, Xiaowei Huang ,Di Wang , Zhe Lin. 2023. Structure and hepatoprotective activity of Usp10/NF-κB/Nrf2 pathway-related Morchella esculenta polysaccharide. Carbohydrate Polymers, 303, 120453. DOI:10.1016/j.carbpol.2022.120453.
