文章題目：Multi-omics analyses of the ulcerative colitis gut microbiome link Bacteroides vulgatus proteases with disease severity

中文標題：多組學用于潰瘍性結腸炎腸道菌群中普通擬桿菌蛋白酶關聯疾病嚴重程度的研究

發表期刊：Nature Microbiology

影響因子：19.4

發表時間：2022.01

樣本類型：人糞便樣本和血清樣本

組學技術：宏蛋白組學、宏基因組測序、16S多樣性、代謝組學

研究背景

潰瘍性結腸炎（UC, Ulcerative colitis），是一種炎癥性腸病(IBD, inflammatory bowel disease)，以結腸的慢性炎癥為特征，黏膜炎癥的嚴重程度、持續性與發病率和死亡率相關。UC是由宿主-菌群穩態的破壞引起的。針對宿主的非特異性免疫抑制劑，如類固醇、硫嘌呤和/或生物制劑，可用于抵消中重度炎癥患者的自然病程。然而，這些治療方法與重大風險相關，并且在充分管理疾病方面往往無效。有許多基于基因組技術的微生物組研究已經確定了與UC的關聯，強調了與UC狀態相關的微生物失衡和組成的時間變化。雖然最近的研究將UC的微生物群分析擴展到了基因組學之外，但仍然不清楚這些變化在本質上是因果關系還是關聯關系。

研究思路

1.發現隊列：40名潰瘍性結腸炎（UC）患者的糞便和血清的組學數據集；獨立驗證隊列，210份糞便樣本，包括 73例UC患者，117 份克羅恩病（CD）患者，20份炎癥性腸病（IBD）患者。

2.整合兩個隊列的數據，研究與UC疾病嚴重性相關的微生物群落的變化情況。

3.使用Caco-2細胞模型測試UC中六種豐度最高的擬桿菌對腸道屏障的影響，并測試了廣譜蛋白酶抑制劑的效果。

4.結合蛋白組學和代謝組學對糞便和血清樣本進行分析，從而識別與UC疾病相關的微生物蛋白質和代謝產物。

研究內容

1、宏組學數據與 IBD 嚴重程度的關聯

雖然該研究選用的隊列人群來自不同的患者群體，但許多臨床嚴重程度相關的指標顯示出高度的相關性。因此，選擇了‘partial Mayo’作為 UC 患者臨床活動性的代表性指標。臨床指標與多組學數據結合分析顯示，疾病嚴重程度與腸道菌群的 α-多樣性和 β-多樣性都具有顯著相關性。該研究團隊進一步分析發現，宏蛋白組學的數據能夠最好的預測 UC 活性，其次是多組學整合的數據和代謝組學的數據。同時，在活動性 UC 患者中，還觀察到了人源蛋白質增加，以及與活動性相關的代謝物類別。

組學多樣性與 IBD 疾病活動度相關

IBD 疾病活動性相關的多組學分析

2、綜合宏基因組-宏蛋白質組學分析揭示了擬桿菌蛋白酶區分活動性UC患者亞群

利用線性回歸模型確定了與臨床疾病嚴重程度最相關的多組學數據特征。從關聯的菌屬中發現擬桿菌蛋白水平占與 UC 疾病活性正相關蛋白的40%-60%，這一關聯性在兩個 UC 隊列中得到證實，并且是 UC 患者人群中獨有的特征。進一步的蛋白功能分析發現，酶家族的比率很高，其中 B. vulgatus 和 B. dorei 蛋白酶占所有擬桿菌蛋白酶總量的40%。該研究團隊采用一種異常值方法，將 B. vulgatus 和 B. dorei 宏基因組豐度與來自 B. vulgatus 和 B. dorei 蛋白酶的總蛋白豐度進行比較，以確定存在高于或低于宏基因組學預期蛋白酶存在的 UC 患者組。因此推測這些蛋白酶在胞外蛋白水解和疾病活動加劇中發揮作用。

整合宏基因組-宏蛋白質組分析揭示擬桿菌肽蛋白酶區分活躍UC患者的一個亞群

3、UC患者組學和擬桿菌上清中蛋白水解的評估

代謝組學和宏肽組學分析證實了蛋白水解在UC患者中的重要性。最初是通過鑒定二肽豐度觀察到的，二肽豐度是與UC疾病活性相關性第二高的代謝物類別。二肽和寡肽是與疾病活性正相關的代謝產物中最常見的兩個化學類別（r > 0.3）分別占總正相關的44%和5.8%。為了進一步分析寡肽，本研究采用從頭測序的方法分析了宏肽組學（來自復雜的多物種樣本的多肽。結果在嚴重UC的糞便樣本和擬桿菌屬蛋白酶生產過剩的患者中發現了更多的肽片段。該數據還揭示了來自人類蛋白質的肽片段的身份，包括來自膠原和粘蛋白的結構蛋白。這些人類蛋白是UC蛋白酶的潛在靶標。已知的中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶-327的切割模式并不是識別肽末端的強信號，這表明中性粒細胞蛋白酶可能不是患者蛋白水解的主要貢獻者。

評估UC患者和擬桿菌上清的蛋白質水解作用

4、蛋白酶抑制在體外和體內均可抑制普通擬桿菌誘導的結腸上皮損傷

使用結腸上皮細胞系 Caco-2 制備單層細胞膜測試了 UC 中六種最豐富的擬桿菌對腸道屏障的影響。結果表明，兩種最豐富的擬桿菌屬物種（B. vulgatus 和 B.dorei）孵育38小時后，跨上皮細胞電阻（TEER）顯著降低。考慮到 B. vulgatus 在 UC 腸道微生物群比健康腸道微生物群中的豐度更高，因此被選擇進行重點研究。接下來，通過添加絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶的蛋白酶抑制劑混合物來評估蛋白酶活性對上皮通透性破壞的貢獻。結果發現，在接種 B. vulgatus 后22小時和38小時，蛋白酶抑制劑顯著增加 TEER，且使用或不使用蛋白酶抑制劑混合物處理的 B. vulgatus 集落形成沒有顯著差異。進一步實驗發現 B. vulgatus 上清液對 TEER 沒有顯著影響，表明目標蛋白酶是膜結合的或者其分泌需要應激源（例如，宿主-微生物相互作用或營養剝奪）的刺激。

蛋白酶抑制對B. vulgatus和糞便移植誘導的體外和體內病理有保護作用

5、UC患者糞便中存在的B.vulgatus蛋白酶將結腸炎嚴重程度移植到無菌小鼠

為了評估 UC 患者中高水平的 B. vulgatus 蛋白酶的存在對腸道炎癥發展的影響程度。將 UC 患者（含有或不含有高水平 B. vulgatus 蛋白酶）的糞便移植到易患結腸炎的 IL10-/- 無菌小鼠。這些小鼠中有一半通過飲用水給予蛋白酶抑制劑混合物（n = 9）。給予富含蛋白酶的糞便樣品的小鼠顯示出 UC 相關的病理指標，而這些表型在移植缺乏 B. vulgatus 蛋白酶的 UC 患者糞便的小鼠中并不明顯。同時，蛋白酶抑制劑混合物顯著減輕了移植蛋白酶豐富的糞便樣品的小鼠表現出的結腸炎。因此建議蛋白酶抑制作為重度 UC 的治療干預手段。

糞便移植實驗的額外測量

研究結論

本研究通過整合糞便宏蛋白質組學、代謝組學、16S擴增子測序、鳥槍法宏基因組學、宏肽組學和血清蛋白質組學，以及體外和體內驗證，證明了微生物組中的某些成員，如B. vulgatus，可能通過蛋白酶活性加劇UC疾病的活動。此外，鑒于本研究的體外和體內實驗的前景，為進一步研究擬桿菌屬蛋白酶抑制作為UC治療方法奠定了基礎。