2018-01-05
2017年剛剛過去，在這一年中，派森諾生物與中科院廣東微生物研究所合作開展了多項研究，已在《Frontiers in Immunology》和《Oncotarget》上相繼發表研究成果。在此基礎上，最新研究又以嚙齒動物為模型，探索巴戟天低聚果糖對阿爾茲海默的益生元功效，并揭示菌群-腸-腦軸在此過程中的作用，研究成果順利發表于《Frontiers in Aging Neuroscience》（最新影響因子:4.504）。
1 研究背景
腸道菌群和很多疾病相關，包括神經性疾病，例如帕金森病（PD）和阿茲海默病（AD）。AD是最常見的中樞神經系統紊亂性疾病，屬于一種慢性神經退行性疾病，影響全世界超過5%的65歲以上的人口。研究表明β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）的積累可能在AD的形成過程中具有重要作用。Aβ可能激活炎癥和毒害神經過程，導致自由基的過剩，細胞內蛋白和其他大分子的氧化性損傷。D-半乳糖是晚期糖基化終末產物，誘導認知障礙，破壞突觸溝通。
本研究將巴戟天（M. officinalis，OMO）分別應用于D-半乳糖和Aβ1-42誘導的AD-型癥狀的大鼠中，并檢測一系列指標，包括學習記憶能力，組織免疫學指標，細胞因子水平，腸道微生物菌群以及小腸和大腦的轉錄表達譜，并在過量抗生素處理的三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的小鼠模型中評估益生元的功效。
2 研究方法
測序技術：Illumina MiSeq + NextSeq 500
測序模式：微生物組16S rRNA基因V3-V4區測序+轉錄組測序
實驗設計：
1、D-半乳糖誘導的缺陷大鼠的實驗設計
2、Aβ1-42誘導的缺陷大鼠的實驗設計
3、TNBS誘導的IBD小鼠中OMO益生元效應評估的實驗設計
3 研究結果
3.1 OMO對D-半乳糖誘導的缺陷大鼠的作用效果
抗氧化和神經保護作用，激活能量代謝和調節乙酰膽堿酯酶
OMO的應用可以改善D-半乳糖誘導的大鼠的學習能力和記憶功能障礙，也可以增強D-半乳糖誘導的缺陷大鼠的抗氧化活性。OMO處理組和模型組相比，小腸組織的萎縮，變形和表面不均勻都有所改善。尤其在OMO-100處理組中，明顯減弱了海馬體結構的分解以及CA1區神經元的丟失，說明OMO的應用改善了D-半乳糖誘導的缺陷大鼠。
圖1 OMO對D-半乳糖誘導的缺陷大鼠的作用效果
OMO應用后腸道菌群的變化
D-半乳糖誘導組的Chao1、ACE、Shannon和npShanon等多樣性指數顯著降低，Simpson指數值則顯著增大的（p<0.05）。尤其是在100 mg/kg/d的OMO處理后，Chao1、ACE、Shannon、npShanon和Simpson的值都趨于和正常組類似的水平。結果表明，OMO應用可以維持D-半乳糖誘導的缺陷大鼠的腸道菌群的多樣性水平。
圖2 OMO對D-半乳糖誘導的缺陷大鼠的腸道菌群的作用效果
3.2 OMO對Aβ1-42誘導的缺陷大鼠的作用效果
OMO應用后對參數指標的改良
OMO的應用可以改善Aβ1-42誘導的大鼠的學習和記憶障礙。Aβ1-42誘導組經OMO處理后細胞因子恢復到基線水平，說明OMO的應用可以顯著改善炎癥水平，更可以促進一些單胺類神經遞質的分泌。OMO處理組可以改善Aβ1-42誘導組引起的萎縮，變形和表面不規則等變化。模型組中的Aβ1-42和Tau細胞所占比例明顯比正常組要高（p<0.05），同時OMO的應用下調了Tau蛋白的表達。
圖3 OMO對Aβ1-42誘導的缺陷大鼠的作用效果
OMO明顯改善了腸道菌群結構
OTU豐度及其分類學組成分析表明，Aβ1-42誘導組微生物群落的多樣性降低，和Aβ1-42的劑量呈現負相關。OMO處理組和Aβ1-42誘導組結果相反，減少了促炎微生物群，富集了抗炎微生物群，表明OMO的應用可以改善腸道菌群的結構。OMO處理組中乳酸菌明顯增加，這說明OMO對AD動物的腸道菌群失調可能具有類似于益生元的有益作用。
圖4 OMO對Aβ1-42誘導的缺陷大鼠的腸道菌群的作用效果
3.3 OMO對TNBS誘導的IBD小鼠益生元效應研究
緩解TNBS結合抗生素引起的組織傷害和炎癥
TNBS處理組的小鼠表現出腹瀉，體重增加趨勢下降。一些抗炎性細胞因子分泌呈現差異性，結腸組織和脾臟組織遭到嚴重損傷。免疫組織化學染色結果表明Foxp3，IL-17，NF-kB，TNF-α偏離了正常水平，尤其是抗生素過量處理組。OMO處理后，所有偏離的參數都回復到基準水平，尤其是OMO+雙歧桿菌處理組。實驗結果表明，OMO和雙歧桿菌在IBD小鼠中協同發揮抗炎作用。
圖5 OMO改善了高劑量抗生素和TNBS誘導的IBD小鼠的病理指標
提升雙歧桿菌的移植能力
TNBS和TNBS+抗生素誘導組中，微生物菌群的多樣性呈現降低趨勢。而OMO可以改善這種菌群失調癥狀。雙歧桿菌的相對豐度明顯增加，其它益生菌如乳桿菌類群在整體菌群中的含量也較豐富。
圖7 OMO對高劑量抗生素和TNBS誘導的IBD大鼠的腸道菌群的作用效果
3.4 Aβ水平對菌群-腸-腦軸的影響
在CA1區注射10/20 mg的Aβ1-42后，每周收集一次糞便樣本，連續收集4周，并通過16S rRNA基因測序進行微生物群落分析，同時檢測Aβ1-42注射后第5周的小腸和腦組織的轉錄表達譜。
Aβ1-42誘導的缺陷大鼠中腸道菌群動態變化和KEGG通路注釋分析
大鼠腸道菌群的結構隨著Aβ1-42發生變化，揭示腦中Aβ1-42水平顯著影響腸道菌群的組成。優勢物種的變化與乳酸桿菌科的豐度，是和Aβ1-42的劑量呈現負相關的。KEGG分析結果表明，AD型嚙齒動物模型改變了氨基酸代謝、外源性物質的生物降解、核苷酸代謝等通路，這些代謝通路通過OMO的應用普遍得到改善。同時還發現，注射Aβ1-42后的第5周，海馬體中Aβ1-42的水平影響了腸道菌群的代謝。
圖8 Aβ1-42對大鼠腸道微生物群的作用效果
圖9腸道微生物代謝系統的KEGG通路富集分析
Aβ1-42注射后缺陷大鼠小腸和腦的轉錄組分析
小腸轉錄組分析
RNA-Seq測序分析發現，308個基因在Aβ1-42-10與對照組之間差異表達，1031個基因在Aβ1-42-20與對照組之間差異表達，1059個基因在Aβ1-42-10與Aβ1-42-20之間差異表達，表明小鼠腦的Aβ1-42水平影響了小腸轉錄組水平。差異基因的GO富集分析結果說明腸道的炎癥反應被激活，而腸道微生物變化可能影響了腸道免疫和炎癥反應。KEGG富集分析結果說明腦中Aβ1-42水平可能影響了腸道的功能。
圖10 小腸轉錄組分析
腦轉錄組分析
差異基因分析結果表明，Aβ1-42水平可以顯著影響腦轉錄組。GO富集分析結果顯示AD的出現依賴于Aβ1-42的積累。KEGG結果表明Aβ1-42水平會影響大腦的功能。
顯著差異表達的基因之間的互作分析說明Aβ1-42水平引起了互作基因數量的增加。KEGG富集分析顯示，Aβ-10注射組的差異表達基因主要富集于蛋白降解、細胞凋亡和血小板激活。以上結果可能是因為結腸細菌無法正常工作或者丟失所致，不易消化的多肽和蛋白不能發酵，短鏈脂肪酸如丁酸鹽、丙酸鹽和醋酸鹽缺乏導致了血小板激活。隨著Aβ1-42水平的增加，KEGG富集分析結果顯示，醛固酮合成和分析、MAPK信號通路收到影響。結合腸道微生物群落多樣性和腸道-腦轉錄組數據，發現海馬體中Aβ1-42水平影響腸道微生物。
圖11 腦組織轉錄組分析
4 總結
本文研究將OMO應用于AD病癥的大鼠（D-半乳糖和Aβ1-42誘導的缺陷大鼠），驗證OMO是否能通過靶向腸道菌群-腸-腦軸有效緩解AD。研究結果表明，傳統藥物巴戟天對各類神經疾病例如AD的作用效果，可能是由于OMO的天然化學組分調整了腸道微生態和腦生理的相互作用。
本研究亮點：
1、研究巴戟天低聚果糖（OMO）對阿爾茲海默癥（AD）的作用；
2、OMO處理可緩解AD大鼠模型的學習及記憶能力障礙，改善氧化應激及炎癥疾病，調節神經遞質的合成與分泌；
3、OMO可緩解腦組織腫脹、神經元凋亡，并下調AD的胞內標記物（Tau蛋白及Aβ1-42）的表達；
4、OMO可維持腸道菌群的多樣性及穩定性；
5、另外，OMO還可調節抗生素誘導的IBD小鼠模型的腸道菌群組成及代謝。
參考文獻
Chen D, Yang X, Yang J, et al. Prebiotic Effect of Fructooligosaccharides from Morinda officinalis on Alzheimer’s Disease in Rodent Models by Targeting the Microbiota-Gut-Brain Axis[J]. Frontiers in Aging Neuroscience, 2017, 09:403.
