2017-12-27
1. 研究背景
家山黧豆，作為人類的食物及動物的飼料，最早可追溯到新石器時代。長期以來，因其營養豐富，具有耐旱、耐澇、耐寒等優良生產性狀,廣受世界各地的青睞。特別是在大旱年份，在其它糧食作物絕收的情況下，仍有較好的收成，因此，被視為干旱及半干旱地區首選的優良作物，但由于其擁有較大的基因組（8.2Gb），易發生外交，并且含有神經細胞毒性物質L-β-L-酰二氨基丙酸（ODAP），過量食用會引起下肢痙攣性癱瘓等原因，使家山黧豆的種植受到限制。目前國內外對于該種作物的研究也較少。可喜的是，今年（2017年）10月在Frontier in Plant Science（IF = 4.298）這一期刊上發表了一篇關于家山黧豆的文章。這篇文章主要是通過Illumina NextSeqTM 500測序平臺從基因層面來揭開家山黧豆的神秘面紗。
2. 實驗內容
2.1 對非洲和歐洲的家山黧豆幼苗期的根，莖和葉的混合樣進行轉錄組測序分析
表1 trinity軟件對家山黧豆轉錄組數據的de novo組裝
圖1 家山黧豆unigene的Nr, GO, KEGG, eggNOG, Swissport 數據庫的注釋分布
如表1所示，家山黧豆測得142053個轉錄本，經過拼接得到27431個Unigene。這27431個Unigene分別和NR，GO，KEGG，eggNOG以及Swissprot五種蛋白數據庫進行比對，發現27431個Unigene 100%比對到NR數據庫中家山黧豆的蛋白序列信息，約72.4%比對到Swissprot數據庫（圖1）。
圖2 家山黧豆unigene的GO功能注釋分布
圖3 家山黧豆unigene的eggNOG功能注釋分布
圖4 家山黧豆unigene的KEGG功能注釋分布
通過對unigene進行功能注釋，發現在GO（圖2）中大多數基因主要功能為生物過程中的代謝過程，細胞成分中的細胞和分子功能中的結合。在eggNOG（圖3）功能注釋中大多數基因主要聚類于的細胞功能未知功能和通用功能預測；在KEGG（圖4）中大多數基因注釋為糖代謝，轉錄，信號轉導，細胞生長和死亡，內分泌系統以及傳染性疾病。
將注釋到的家山黧豆的c39901_g1_il基因與近親——豌豆的SGR基因進行比對（圖5），發現二者具有高度的一致性，并且功能類似，所以家山黧豆中的c39901_g1_il基因是豌豆SGR基因的同系物。這些轉錄組數據對于家山黧豆的基因的進一步挖掘和分子育種有著極大的幫助。
圖5 家山黧豆c39901_g1_il基因與豌豆的SGR基因蛋白序列比對結果
2.2 對43種家山黧豆進行SSR和KASP標記物的檢測
SSR是種植資源評價和有效繁殖的強有力的標志之一，國內外眾多研究小組在很多領域中使用這種分子工具，如基因多樣性，DNA指紋、遺傳連鎖圖譜、QTL映射和等位基因等研究領域。本篇文章作者通過使用微衛星識別工具對兩種家山黧豆的轉錄組測序結果進行SSR高通量篩選，篩選出含有SSR的序列后，根據其側翼設計引物。對43種家山黧豆幼苗期的葉子進行基因組DNA提取，進行PCR，產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后硝酸銀染色。最終確定了87個多態性引物和88個單態性引物。
對于SNP的檢測，目前存在很多種方法，例如等位基因特異性PCR，熒光定量檢測，分子信標與基因芯片SNP基因分型等，但這些方法均價格昂貴，而KASP作為一種新型的強有力的的SNP檢測方法，有著其他方法不可比擬的優勢，結果精準，效率高，價格親民，使得這一方法發展迅速。本篇文章對篩選出的146406 個SNP 隨機挑選50個SNP 基因座，使用KASP技術進行驗證，發現其中42個SNP基因座可作為KASP標志物，其中2個是單態性的，40個是多態性的。根據這一結果可以發現，較高比例的SNP可以作為KASP標志物，那么未來可以將特定特征的SNP作為KASP標志物確定的參考目標。
使用兩種計算方法對43個家山黧豆的87個SSR和42個KASP標志物制作系統樹狀圖（圖6）。雖然這兩種計算方法得到的系統樹狀圖存在細小差別，但所有組別之間的關系是相似的。SSR和KASP標志物的結果對于評估家山黧豆基因的遺傳多樣性有著非常重要的作用，同時也為家山黧豆的基因改良育種提供理論參考。
圖6 家山黧豆SSR和KASP標志物系統樹狀圖
本研究的測序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
參考文獻：
X Hao, T Yang, R Liu, J Hu, Y Yao, & M Burlyaeva, et al. (2017). An rna sequencing transcriptome analysis of grasspea (lathyrus sativus l.) and development of ssr and kasp markers. Frontiers in Plant Science, 8, 1873.
